对食品中脱氢乙酸HPLC检验方法的改进

□ 于喆源 甘肃省张掖市食品药品检验检测中心 张 婕 甘肃省兰州市食品药品检验所

对食品中脱氢乙酸HPLC检验方法的改进

□ 于喆源 甘肃省张掖市食品药品检验检测中心 张 婕 甘肃省兰州市食品药品检验所

在脱氢乙酸的高效液相法检测时，常会因为保留时间漂移和峰形拖尾严重，影响对目标物的定性和定量。本文试 图通过对脱氢乙酸化学性质的分析及考察样品pH、流动相pH、色谱柱类型对检测的影响，有效控制拖尾和保留时间漂移，提高检测准确性。研究结果表明：脱氢乙酸在中性或碱性环境下，烯醇互变后的-O-结构次级保留是造成峰形不对称和保留时间漂移的主要原因。通过采用封尾工艺的色谱柱，pH=4．5的醋酸钠缓冲液-甲醇（85︰15）体系流动相可以得到较为理想的保留时间，峰形及响应，样品pH在5～7有较好的稳定性。该方法的回收率、精密度、检出限、重现性良好，能更好地满足样品检验的需求。

高效液相色谱；pH值；脱氢乙酸

脱氢乙酸钠是一种广谱类、抑菌力极强的食品防腐剂，分子结构式如图1所示。对霉菌、酵母菌、细菌的抑制能力特别强，广泛应用于果汁、腐乳、酱菜、人造奶油、乳酸菌饮料、果酱和糕点等各类食品加工行业中[1-2]。在我国为合法添加剂，最大限制为0.3 g/kg。

图1 脱氢乙酸（钠）分子结构式图

目前，脱氢乙酸的检测国标方法为气相色谱法和高效液相色谱法[3]。气相色谱法的前处理复杂，且整个实验流程较为繁琐，目前大部分实验室依然选择使用液相色谱法进行检测分析[4-5]。在实验中，依据国标方法，采用C18色谱柱，乙酸铵缓冲盐溶液-甲醇（90︰10）体系为流动相时，经常出现保留时间漂移和严重的峰形拖尾现象，通常的解决思路是进一步净化减少基质影响或调节流动相比例，使其满足分析要求。但净化方法的选择及频繁调整流动相比例会造成实验复杂程度的增加，增加实验的不确定性。因此，本文通过分析脱氢乙酸化学性质，研究色谱柱工艺和样品pH、流动相pH对分析的影响，并提出改进方法，尽可能达到在稳定色谱条件分析目标物的目的。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪：安捷伦1260型，配有二极管阵列检测器；万分之一天平：EL204-IC，瑞士梅特勒；千分之一天平：ML503/02，瑞士梅特勒；离心机：10 000 r/min，tgl-16a高速离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；酸度计：梅特勒320型，瑞士梅特勒；甲醇：色谱纯，德国默克进口；脱氢乙酸标准品：纯度≥99.5%，美国sigma公司；其他试剂均为优级纯；实验用水为满足GB/T 6682的一级水。

1.2 标准溶液的配置

脱氢乙酸储备液（1.0 mg/mL）：精密称取脱氢乙酸标准品100 mg至100 mL容量瓶，用20 mL氢氧化钠溶液（20 g/L）溶解后用水定容。4 ℃保存，3个月有效。

脱氢乙酸标准曲线工作液：分别吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10 mL和20 mL的脱氢乙酸储备液，用水定容至100 mL容量瓶中。制成浓度为1.00、5.00、10.0、50.0、100 μg/mL和200 μg/mL的标准曲线工作液。4 ℃保存，一个月有效。

1.3 样品处理

称取样品1 g（液体样品吸取1 g）至50 mL离心管中，精密加水15 mL，超声处理30 min，然后分别精密加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各2.5 mL，振摇，8 000 r/min离心10 min，取上清液，分别用乙酸和氢氧化钠溶液调节pH为5、7、9，过0.45 μm滤膜后上机。

1.4 色谱条件

第一组：C18未封尾+乙酸铵（0.02 mol/L）缓冲液-甲醇（90︰10）体系流动相。

第二组：C18封尾柱+乙酸铵（0.02 mol/L）缓冲液-甲醇（90︰10）体系流动相。

第三组：C18封尾柱+乙酸铵（0.02 mol/L，后用乙酸调节pH为5.5）缓冲液-甲醇（90︰10）体系流动相。

第四组：C18封尾柱+乙酸钠（pH=4.5）缓冲液-甲醇（90︰10）体系流动相。

封尾柱为：Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）

非封尾柱为：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

检测器波长：293 nm；进样量：10 μL，流速1 mL/min，保留时间定性，峰面积定量。

2 结果与分析

2.1 样品pH对检验的影响

依据上述样品处理方法，调节pH后，国标色谱条件（第一组）进样，考察其保留时间，峰形对称性。如图2所示。

由图2可以得出，样品pH的变化对脱氢乙酸的保留行为在酸性、中性情况下的影响不显著，但在碱性环境下，脱氢乙酸会得到裂峰。故拖尾因子未标出，且不能作为定量定性依据。分析原因为在流动相中，部分离子态脱氢乙酸（钠）变为分子态，保留行为发生改变，使其洗脱不能同步进行，故出现裂峰。国标GB 5009.121-2016要求对样品提取液要调节pH值至中性或酸性，分析原因是多数糕点会使用纯碱等碱性物质，所以碱性较强，不利于分析。因此，确定样品pH为7为最佳。

2.2 色谱柱工艺对检验的影响

国标规定为C18反相色谱柱，但在实验过程中，因色谱柱选择不同，其峰形存在很大差异。在未使用封尾工艺的色谱柱上，国标色谱条件会使峰明显拖尾，如图3所示；且保留时间漂移明显；在使用封尾柱后，拖尾情况改善明显，如图4所示；且保留时间稳定。具体保留时间对比见表1。

脱氢乙酸属于非羧基酸类，在中性或碱性环境下，因为结构中存在C=O双键的共轭稳定作用，所以使其中一个C=O烯醇互变为C-O-的结构，和色谱柱填料表面未键合的硅羟基残基产生强的次级保留，使得峰形变形严重，保留时间漂移。采用封尾柱后，未键合硅羟基大部分被屏蔽，峰形对称性好转，保留时间稳定。综上，采用封尾工艺的色谱柱更加有利于在脱氢乙酸的分析中得到稳定的色谱响应。

2.3 流动相pH对检测的影响

表2是样品pH为7，采用封尾工艺色谱柱时，不同pH流动相对其峰形和保留时间的影响。由表2可知，流动相pH对于脱氢乙酸的保留时间无明显影响，但对其峰形对称性有较为明显的影响。在使用中性体系流动相时，峰形对称性差，随着流动相酸性的增加，峰形对称性好转，当pH达到4.5时，峰形对称性已到达1.01。分析原因，在酸性环境下，脱氢乙酸烯醇互变产生的具有明显碱性的-O-几乎不存在，脱氢乙酸以分子形态存在，色谱柱保留行为稳定，且因-O-不存在，使得次级保留基本消失，故能得到良好峰形。综上，乙酸钠（pH=4.5）缓冲液-甲醇体系流动相更适合脱氢乙酸分析。

2.4 标准曲线线性，精密度和最低检出限

使用1.2配置的标准曲线工作液，在上述实验中得到的最佳条件进样，以浓度为横坐标（x轴），峰面积为纵坐标（y轴）绘制标准曲线，得到回归方程：y=22.4379 9x-17.156 86，r=0.999 8，线性良好。6针连续进样，RSD小于0.7%，精密度良好。在该条件下，以3倍信噪比为检出限，以10倍信噪比为定量限，检测线达到国标GB 5009.121-2016对检出限、定量限的规定。

图2 不同pH值对RT、拖尾因子的影响

图3 采用未封尾色谱柱色谱图

图4 采用封尾工艺色谱柱色谱图

表1 柱工艺对保留时间的影响表

表2 流动相pH值对保留时间及拖尾因子的影响表

3 结论

通过对脱氢乙酸化学性质的分析和实验证明，在脱氢乙酸的分析中，采用封尾色谱柱和偏酸性流动相可以得到稳定的结果。而且在实验中也证明，当流动相构成为酸钠（pH=4.5）缓冲液-甲醇体系时，通过调整两相比例，对峰形和稳定性影响不显著。故从实验效率的角度考虑，选择85︰15的比例作为实验比例，可以在保证稳定的情况下，有效提高实验效率，减少工作负荷。

[1]骆萌．脱氢乙酸及相关化合物生产技术[J]．化工中间体，2004(1)：31-33．

[2]明立艳，张忠义．高效液相色谱法测定食品中脱氢乙酸含量[J]．食品研究与开发，2009(3)：106-108．

[3]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局．GB/T 23377-2009 食品中脱氢乙酸的测定 高效液相色谱法[S]．北京：中国标准出版社，2009．

[4]王若燕，王立 ．高效液相色谱法测定食品中脱氢乙酸含量的研究[J]．浙江科学学院学报，2003(11)：97-99．

[5]曾丽娟．高效液相色谱法测定月饼中防腐剂的方法研究[J]．计量与测试技术，2005(9)：42-43．

于喆源（1991—），男，甘肃张掖人，本科，工程师。研究方向：食品与药品检验检测。