补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞骨钙素合成的影响

李 敏 高 毅穆春晖 王彦敏都广艳李立芳 杨梦华（河北省中医院口腔科，河北 石家庄 0500）

实验研究

补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞骨钙素合成的影响

李 敏 高 毅△穆春晖 王彦敏1都广艳2李立芳 杨梦华
（河北省中医院口腔科，河北 石家庄 050011）

目的 观察补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞（MC3T3－E1细胞）骨钙素（OCN）合成的影响。方法 用10%补肾活血固齿方含药血清、无药血清、胎牛血清分别培养MC3T3－E1细胞24 h、48 h、72 h，125Ⅰ放射免疫法检测3组细胞上清液中OCN的含量。结果 含药血清组24、48、72 h OCN含量与无药血清组、胎牛血清组同期比较差异均有统计学意义（P＜0.05），含药血清组24、48、72 h OCN含量显著高于无药血清组、胎牛血清组同期。结论 补肾活血固齿方可提高MC3T3－E1细胞分泌OCN的水平，促进该细胞分化为成骨细胞，加速骨的形成。

成骨细胞；小鼠；骨钙素；牙周炎；中药疗法

牙周炎是发生在牙周组织的疾病，可导致成年人牙齿的丧失，其不但危害口腔健康，而且与全身健康及全身疾病存在双向的密切关联［1］。河北省中医院口腔科应用补肾活血固齿方治疗牙周炎临床疗效较好，但其作用机制不甚明确。前期实验观察补肾活血固齿方对颅顶前成骨细胞（MC3T3－E1细胞）增殖及细胞周期均无明显影响［2］。其是否通过促进MC3T3－E1细胞分化为成骨细胞，促进牙槽骨的再生有待研究。本实验应用补肾活血固齿方含药血清作用于MC3T3－E1细胞，观察其对骨钙素（osteocalcin，OCN）分泌的影响，探讨该方剂治疗牙周炎的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 α－最低基础培养基（α－MEM），β－巯基乙醇（北京鼎国生物技术有限责任公司），肌醇（北京索莱宝科技股份有限公司），叶酸（Amresco），胰酶（Amresco），乙二胺四乙酸（EDTA）（天津市永大化学试剂开发公司），戊巴比妥（华北制药股份有限公司），胎牛血清（PAA Laboraties GmbH），125Ⅰ骨钙素放免分析盒（晶赛生物技术公司）。

BSC－1100ⅡA2生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司），HF240二氧化碳（CO2）培养箱（上海力申科学仪器有限公司），TE2000－U荧光倒置显微镜（NiKon），B40型医用低速离心机（安新县白洋离心机厂），D－37520高速离心机（Thermo ELECTRON CORPORATION），HKAA2450－230精密电子天平（BEL Engineering），水浴恒温振荡器（江苏金坛市江南仪器厂），GC－1200γ放射免疫计数仪。

1.2 实验动物 清洁级健康雄性SD系大鼠20只，体质量280～300 g，由河北医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证编号1312020。饲养条件室温保持在18～25℃，空气流通，12 h维持光照，动物在笼中自由摄食饮水。饲料由河北医科大学实验动物中心提供。

1.3 MC3T3－E1细胞培养 购自中国科学院上海细胞库的MC3T3－E1细胞，将原培养液吸去，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2遍，加1 mL 0.25%胰酶，于37℃下消化1 min，加入1.5 mLα－MEM培养基终止消化反应，用吸管反复吹打细胞，使其充分悬浮，而后移到15 mL离心管中，1 000 r／min离心5 min后将上清液吸去，加入4.5 mLα－MEM培养基，用吸管轻轻吹打，使位于管底的细胞均匀分散悬浮。再取3个培养瓶，向每个瓶中滴入1.5 mL细胞悬液，而后置于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞贴壁后，每隔2 d换液1次。培养5～6 d，细胞铺满瓶底70～80%时处于对数生长期时进行下一步的实验。

1.4 中药制备 补肾活血固齿方药物组成：淫羊藿15 g，补骨脂15 g，熟地黄10 g，当归10 g，丹参10 g，知母10 g，甘草3 g。药剂制备：药物加10倍量蒸馏水煎煮1.5 h，过滤；加同量蒸馏水重煎1.5 h，过滤。合并滤液浓缩至150 mL，装袋备用。

1.5 实验分组及血清制备 20只大鼠随机分为2组，无药血清组10只，含药血清组10只。含药血清组按体表面积的方法折算人体等效剂量，按4.875 g生药／kg体质量计算用药量，每日灌胃2次，连续灌胃7 d，最后1 d第2次灌胃后间隔2 h再次灌胃，于末次给药后1 h，1.2%戊巴比妥麻醉大鼠，经腹主动脉采血。每只大鼠的血液置于不同离心管中，冷置1 h后，3 000 r／min离心20 min，将同组各只大鼠离心管中的上清液置于同一离心管中混合以减少不同大鼠的个体差异，56℃灭活30 min，滤菌器抽滤除菌后分装，－20℃保存备用。胎牛血清组、无药血清组大鼠等容积0.9%氯化钠注射液灌胃，血清制备方法同前。血清直接购买自PAALa boraties GmbH。

1.6125Ⅰ放射免疫法检测MC3T3－E1细胞上清液中OCN含量 用0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的MC3T3－E1细胞，制成细胞悬液，取3块24孔板每孔接种MC3T3－E1细胞15 000个，37℃，5%CO2培养箱中培养2 d。培养2 d后，3块板分别换用10%含药血清、无药血清、胎牛血清培基培养细胞，每块24孔板每组血清均设8个复孔。于培养24、48、72 min各拿出一块24孔板，吸出培基，分别将其加入微量离心管（eppendorf，EP管）中，1 000 r／min离心5 min。吸取每个EP管中的上清液分别移入新的EP管，再次离心，再次吸取每个EP管中的上清液分别移入新的EP管进行OCN测定。严格依据骨钙素放免试剂盒说明操作，每个样品中加入100μL125Ⅰ－OCN，100μL OCN抗体，充分摇匀后，4℃静置24 h，加入分离试剂500μL，充分摇匀后，4℃放置20 min，3 500 r／min离心25 min，弃上清后，上机测沉淀物的每min计数值，按照标准品曲线得到样品OCN含量，结果以ng／mL表示。

1.7 统计学方法 数据采用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（¯x ±s）表示，多组的组间比较采用方差分析，两两比较用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义，P＞0.05为差异无统计学意义。

2 结 果

3组血清中OCN含量比较见表1。

表1 3组血清中OCN含量比较 n＝8，ng／m L，¯x±s

由表1可见，24、48、72 h时含药血清组OCN含量显著高于无药血清组及胎牛血清组同期，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；无药血清组与胎牛血清组比较差异无统计学意义（P＞0.05），含量相当。含药血清组组内数据比较差异均有统计学意义（P＜0.05），说明随着药物作用时间的延长，OCN水平增加，药物作用显示出具有时间依赖效应。

3 讨 论

牙周炎是口腔科第二大疾病，其发病机制是致病因素导致牙周膜内的胶原破坏，结合上皮向根方增殖，牙龈生理附着被破坏，牙龈沟加深，形成牙周袋，炎症继续向深部发展，致使牙槽骨破坏吸收最终导致牙齿松动脱落。牙周炎除了导致成年人牙齿丧失外，还可诱发全身性疾病，危害人类健康。治疗牙周炎的关键是阻止牙槽骨破坏吸收或促进牙槽骨的再生，而牙槽骨的代谢依赖于成骨细胞和破骨细胞的平衡而起调节作用。

牙周炎属中医学“牙宣”“齿豁”范畴。中医病机为脾胃湿热、气血不足、肾精亏损［3］。李敏等［4］将180例慢性牙周炎患者随机分为2组，治疗组120例，对照组60例。对照组行牙周基础治疗（全口洁治、龈下刮治术）；治疗组在对照组治疗基础上辨证为脾胃湿热型、气血不足型、肾精亏损型3型治疗。结果：治疗组总有效率97%，对照组总有效率60%，治疗组疗效优于对照组（P＜0.05）。补肾活血固齿方以“肾主骨”理论为基础，方中淫羊藿、补骨脂补肾助阳，强筋壮骨；熟地黄、当归、丹参补血活血，填精益髓；知母清热泻火，滋阴润燥；甘草清热解毒，调和诸药。其中淫羊藿是一种传统补肾中药，经常被用于治疗骨质疏松症。实验证实其主要成分淫羊藿苷体外可以增加成骨细胞增殖分化，促进骨形成，抑制破骨细胞的分化［5－6］。

目前用于体外实验研究的成骨细胞有2个主要来源：原代分离培养的成骨细胞和成骨细胞株。原代细胞取材于活体组织，其优点是取材的组织、细胞离体时间短，生物学形状发生变化小，在一定程度上反映了体内状态，其缺点是受到取材和培养条件等诸多因素的干扰，会影响细胞增殖、分化等生物学特性，不同批次取得的原代细胞稳定性差［7］。该实验采用的MC3T3－E1细胞是日本学者Kadama等1981年从新生C57BL／6小鼠颅顶骨细胞中建株的成骨细胞系，与原代培养颅顶成骨细胞具有类似的生物学特性，其增殖稳定，可无限传代，常用作研究体外成骨细胞分化及骨代谢的细胞模型［8］。MC3T3－E1细胞系包括4、14、24和30 4种亚型，本研究选用的亚克隆14（MC3T3－subclone14）为该细胞系中的高分化亚克隆型，与原代培养的颅顶成骨细胞的生物行为类似，是研究体外成骨细胞分化模型的较好选择。高毅等［9］通过研究补肾活血固齿方对小鼠MC3T3－E1细胞碱性磷酸酶（Alkaline Phosphosphatase，ALP）活性的影响，探讨该方剂成骨的作用机制。实验中用10%含药血清、无药血清、胎牛血清分别培养MC3T3－E1细胞24、48、72 h，检测MC3T3－E1细胞中ALP的活性，观察补肾活血固齿方对MC3T3－E1细胞分化的影响。结果发现含药血清组MC3T3－E1细胞中ALP活性显著高于胎牛血清组、无药血清组，并且随着作用时间的延长，药物作用效果显示时间依赖效应。实验认为补肾活血固齿方可时间依赖性增强MC3T3－E1细胞中ALP活性，促进MC3T3－E1细胞向成骨细胞分化。

“血清药理学”是日本学者田代真一于1988年提出的，是给予动物灌服中药或中药复方一定时间后，采集、分离动物血清，再用含有药物成分的血清进行体外实验的一种方法［10］。此种方法不仅具有体外实验的优点，避免了中药粗提物的体外实验结果评价药物的体内效应的不客观及不确切性，含药血清能更好地反映药物在体内环境中产生药理效应的真实过程，在理论上更具科学性和真实性。而且该方法操作简单，可控性强，重复性好，费用低廉［11］。该方法的缺点是还不能完全替代在体动物的中药药理实验方法，另外为了取得稳定的血药浓度，需要每隔1个半衰期给药1次，连续给4～6个半衰期，以达到最大血药浓度，因中药复方成分复杂，半衰期很难测定，所以灌胃7～10 d是常规的给药方案［12］。血清中含有多种生物活性物质，对体外培养的细胞可能会产生一定影响，干扰客观评价药物疗效。有学者提出含药血清应该经56℃水浴30 min灭活，灭活后的血清其正常生物活性基本丧失，突出血清中中药有效成分的作用，并最大程度地减少微生物对细胞培养的感染［12］。穆春晖等［13］应用血清药理学的方法，将含药血清加入培基中检测MC3T3－E1细胞的指标变化以评估中药方剂对前成骨细胞的作用，应用未灭活的无药血清及含药血清培育MC3T3－E1细胞，发现贴壁细胞经上述血清孵育12 h后，大量细胞出现伪足收缩，由多角形变成球形并漂浮死亡，认为出现这种现象的原因是未经灭活的血清中含有补体等大量生物活性物质，干扰细胞正常生长造成死亡。在随后的实验中，使用经灭活后的血清孵育细胞，细胞生长正常。

成骨细胞分化晚期，即成骨细胞进入矿化期时，与细胞外基质中羟磷灰石沉积相关的基因如OCN等表达达到高峰。OCN又被称为γ－羧基谷氨酸蛋白或骨依赖维生素K蛋白，是成骨细胞特异合成和分泌的一种非胶原骨蛋白。其生理功能是保持骨的正常矿化，被认为是成骨细胞分化的主要指标之一［14－15］，也是骨形成或骨转换的重要标志。羧基化后的OCN与细胞外基质中的钙、磷结合，而后沿胶原分子的长轴，钙和磷结合到胶原分子的侧链上的胶原氨基酸残基上，形成羟磷灰石结晶，使骨矿化。因此，本实验以OCN含量为指标，检测补肾活血固齿方对MC3T3－E1细胞分化、成熟的影响。本实验用含药血清、无药血清、胎牛血清的培养基分别培养MC3T3－E1细胞，检测24、48、72 h细胞上清液中OCN的含量，统计结果显示，24、48、72 h含药血清组OCN含量显著高于无药血清组及胎牛血清组同期，差异均有统计学意义（P＜0.05），随着作用时间的延长，OCN水平增加，药物作用效果显示出时间依赖效应。结果提示补肾活血固齿方可提高MC3T3－E1细胞分泌OCN的水平，促进该细胞向成骨细胞分化，促进牙槽骨的再生而发挥其治疗牙周炎的药物作用。

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Effects of Bushen－huoxue－guchi formula on the synthesis of OCN of pre－osteoblasts in m ice calvarium

LI Min*，GAO Yi，MU Chunhui，et al．*
Department of Stomatology，Hospital of Traditional Chinese Medicine in Hebei Province，Hebei，Shijiazhuang 050011

Objective To observe the effects of Bushen－huoxue－guchi formula on the synthesis of osteocalcin（OCN）of pre－osteoblasts inmice calvarium（MC3T3－E1 cells）.M ethods MC3T3－E1 cellswere cultured respectively for 24 h，48 h and 72 h by serum containing drug of10%Bushen－huoxue－guchi formula，drug free serum and fetal bovine serum（FBS），and the contents of OCN in 3 groupswere tested by125I radioimmunoassay.Results Therewere statistical differences on the contentofOCN among the serum containing drug group，drug free serum and FBS group at the same period（24 h，48 h and 72 h）（P＜0.05），and which in serum containing drug group were higher than those in the drug free serum group and fetal bovine serum group at the same period（24 h，48 h and 72 h）（P＜0.05）.Conclusion Bushen－huoxue－guchi formula can improve the level of MC3T3－E1 cells secreting OCN，promote the differentiation of the cells into osteoblasts and accelerate the formation of bone.

Osteoblasts；Rat；OCN；Periodontitis； Traditional Chinesemedicine therapy

R－332；R341.3；R977.6；R781.42

A

1002－2619（2017）08－1226－04

2017－01－04）

（本文编辑：董军杰）

10．3969／j．issn．1002－2619．2017．08．027

△通讯作者：河北省中医院口腔科，河北 石家庄 050011

1 河北省石家庄市第三医院口腔科，河北 石家庄 050011

2 石家庄市医学高等专科学校口腔医学教研室，河北 石家庄050010

李敏（1979—），女，主治医师，硕士。从事口腔内科疾病的临床研究