含羟基的2-取代萘醌类衍生物对肝癌细胞Hep3B的抑制作用

刘仁，蒋雪园，吴丹丹，金成浩，申贵男

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

含羟基的2-取代萘醌类衍生物对肝癌细胞Hep3B的抑制作用

刘仁，蒋雪园，吴丹丹，金成浩，申贵男

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

萘醌类化合物普遍被报道具备较好的抗肿瘤能力。以1，5-二羟基萘为原料，经五步反应得到了4个末端含有羟基的萘醌类衍生物（6a-d）和1个未含羟基的萘醌类衍生物（6e），并通过质谱和1H NMR进行结构鉴定，采用MTT法评价了5种化合物对人肝癌细胞Hep3B细胞系的生长抑制作用。结果显示取代基末端含羟基的萘醌类衍生物的抗肿瘤活性与碳链长度有密切关系。研究中的6 d对肿癌细胞Hep3B抑制活性最强，IC50为9.1 μmol·mL-1。

萘醌类衍生物；Hep3B；抗癌；抑制

紫草素（shikonin）是一种从传统中药材紫草的活性成分，属于萘醌类化合物[1]，萘醌类衍生物因其抗癌[2]、抗真菌[3]、抗疟疾[4]、退热[5]以及延缓机体衰老[6]等多种生物活性受到国内外药物化学研究学者的广泛关注。但其水溶性差一直是阻碍其广泛应用的问题之一。本研究为了解决其水溶性差的问题，以1，5-二羟基萘为原料，通过1，5-位羟基的甲基化[7]、4和8位的溴化[8]、甲氧基化及1，4-位甲氧基的氧化获得中间体化合物：5，8-位含有甲氧基的1，4-萘醌，并通过迈克尔加成反应合成了末端含有羟基的萘醌类衍生物。产物通过MTT法评价了其对Hep3B肝癌细胞的抑制作用，旨在筛选活性更好的萘醌类衍生物，为今后的萘醌类衍生物对抗肿瘤的研究提供合理的构效关系方面的理论基础。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1，5-二羟基萘（AR Sigma-Aldrich）；硫酸二甲酯（AR Sigma-Aldrich）；N-溴代丁二酰亚胺（AR Sigma-Aldrich）；甲醇钠（AR阿拉丁）；碘化钾（AR华蓝试剂）；硝酸铈铵（AR Sigma-Aldrich）；3-巯基丙醇（AR阿拉丁）；4-巯基丁醇（AR Sigma-Aldrich）；5-巯基戊醇（AR阿拉丁）；6-巯基己醇（AR Sigma-Aldrich）；己硫醇（AR阿拉丁）。

1.2 仪器

Infinite M200pro酶标仪，Bruker-Esquire3000离子阱液相色谱质谱仪，RE-52A旋转蒸发器，Bruker JNM-AL400核磁共振波谱仪。

1.3 方法

1.3.1 萘醌类衍生物的化学合成和修饰

将1，5-二羟基萘（1）于25℃弱碱性溶液中用硫酸二甲酯进行羟基的甲基化得到1，5-二甲氧基萘（2）。经溴化反应使用N-溴代丁二酰亚胺（NBS）的自由基反应机制进行溴化反应，降低了传统溴化反应试剂毒性大的缺点，顺利得到4，8-二溴-1，5-二甲氧基萘（3）。利用甲醇钠在碘化钾的催化下，甲醇和二甲基甲酰胺混合物为溶剂加热回流约30 h，乙酸乙酯重结晶得1，4，5，8-四甲氧基萘（4），应用硝酸铈铵在乙腈和氯仿混合溶剂中氧化得到关键中间体5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（DMNQ）（5）。最后利用迈克尔加成反应将末端含有羟基的化合物6a-d以及不含羟基的化合物6e顺利加成于2-位（见图1）。产物的结构通过核磁、质谱等波谱学方法鉴定。

图1 萘醌类衍生物的合成Fig.1The synthesis of naphthoquinone derivatives

1.3.2 细胞抑制活性检测

将培养到2p的细胞，用0.25%的胰酶消化细胞5 min致细胞完全悬浮，加入完全培养基阻断胰酶活性，1 000 rpm离心3 min后，用细胞培养液将细胞配成1×105·mL-1，种入96微孔板，每孔加入100 μL Hep3B细胞悬液后，放入5%CO2、37℃恒温培养箱内，培养22 h后，取出96孔板。吸出细胞培养液，每孔加入100 μL含有1%FBS的DMEM高糖培养液，饥饿处理2 h后，实验组加入1 μL化合物溶液（化合物的终末浓度分别为0.1，1，10，100 μmol·mL-1）对照组加入1 μL溶剂对照液。化合物处理采用4个浓度梯度，8个复孔，各溶剂对照也为8个复孔。

处理化合物后培养24 h，用平衡磷酸盐缓冲液冲洗3次，去除死亡的细胞。每孔加入浓度为5 mg·mL-1的MTT染液10 μL，置于恒温培养箱内4 h。

吸净上清液，各孔加入100 μL DMSO，置于培养箱10～15 min，使甲瓒溶解。用多功能酶标仪测定（测定波长为570 nm）各浓度条件下的OD值，计算细胞的存活率计算公式：细胞存活率=（实验组OD值/对照组OD值）×100%，实验重复3次。细胞生长抑制率=100%－细胞存活率。运用GraphPad Prism 5软件统计分析，计算出细胞生长抑制率达到50%时的化合物浓度，即IC50值，比较5种化合物物对Hep3B细胞抑制作用。

2 结果与讨论

2.1 5种萘醌类衍生物的结构鉴定

为了验证获得的6种萘醌类衍生物的准确性，进行了1H-NMR（TMS为内标）和Mass鉴定，数据如下：

1H-NMR及质谱的数据显示，通过迈克尔加成反应获得的5种化合物均属于萘醌类衍生物，并且其化学结构和分子量符合预先的合成设计，保证了化合物的准确性。

2.2 MTT法检测萘醌类衍生物对Hep3B的细胞毒性

称取并溶解合成的5种萘醌类衍生物6a、6b、6c、6d、6e分别以0.1、1、10、100 μmol·mL-1处理Hep3B细胞24 h，通过MTT法检测5种化合物的细胞毒性，其结果如表1。

表15 种萘醌类衍生物对Hep3B细胞的抑制活性Table 1The inhibitory effect of compounds 6a-6e on Hep3B

受试的5种萘醌类衍生物具有同样的DMNQ母核，不同之处在于它们的2-位巯基取代基的碳链长度，而化合物6e的2-位取代基末端未含有羟基。结果表明6e相对于其他化合物显示较差的抗癌活性，说明亲水性基团羟基对与抗癌活性就有明显的影响。可能是亲水性基团更易与细胞的活性部位发生分子间的氢键，从而对Hep3B细胞有较好的增殖抑制作用。末端含有羟基的4个化合物相比，6a的活性相对较差一些，说明碳链长度对抗癌抑制作用有一定的影响。而碳链长度在4～5时没有显著的差异。说明2-位短链取代时效果较差，中等长度时显示了较好的抗癌抑制活性。至于长链或超长链的末端含有羟基的2-位取代化合物的抗癌活性正在研究中。

3 结论

化学合成方法以1，5-二羟基萘为原料经五步合成了5种2-位取代的萘醌类衍生物，包括不同长度的末端含有羟基（6a、6b、6c和6d）和不含羟基的化合物（6e）。并采用MTT法评价了这类化合物对人肝癌细胞系Hep3B的抑制作用。2-（4-羟基正丁巯基）-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（6d）的对肿瘤细胞Hep3B抑制活性最强。结果表明萘醌类化合物的抗癌活性与其结构有着密切的关系。萘醌类取代基的亲水基团及碳链长度是决定5，8-二甲氧基-1，4-萘醌为母核的萘醌类化合物对Hep3B生长抑制的主要因素，碳链越长显示更强的抑制作用。应用的萘醌类衍生物结构的修饰方案，可以提高其对Hep3B的抑制作用，阐明了碳链长度及亲水基团对抗癌抑制作用的构效关系，但具体的化合物与Hep3B细胞作用机理有待于后续研究。

［1］张亚宏，甘莹，郭子华，等．紫草素通过ROS/p38信号通路诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡［J］.中国药理学通报，2011，27（6）：864-867.

［2］Chakrabarty S，Roy M，Hazra B，et al.Induction of apoptosis in human cancer cell lines by diospyrin，a plant-derived bisnaphthoquinonoid，anditssyntheticderivatives［J］. Cancer Lett，2002，188（1/2）：85-93.

［3］Adeniyi BA，Fong HH，Pezzuto JM，et al.Antibacterial activity of diospyrin，isodiospyrin and bisisodiospyrin from the root of Diospyros piscatoria（Gurke）（Ebenaceae）［J］. Phytother Res，2000，14（2）：112-117.

［4］De Rezende LC，Fumagalli F，Bortolin MS，et al.In vivo antimalarial activity of novel 2-hydroxy-3-anilino-1，4-naphthoquinones obtained by epoxide ring-opening reaction［J］.Bioorg Med Chem Lett，2013，23（16）：4583-4586.

［5］Hernández-Pérez M，Rabanal RM，de la Torre MC，et al. Analgesic，anti-inflammatory，antipyretic and haematological effects of aethiopinone，an o-naphthoquinone diterpenoid from Salvia aethiopis roots and two hemisynthetic derivatives［J］.Planta Med，1995，61（6）：505-509.

［6］王昊乾，孔令祖，申贵男，等．新型萘醌类衍生物对细胞衰老的抑制作用［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015，27（4）：72-76.

［7］朱茂电，刘绍英，贾树勇，等．碳酸二甲酯甲基化反应催化剂和反应机理研究进展［J］.化学试剂，2012，34（7）：615-619.

［8］朱园园，古双喜，段婷，等．1-溴-6-氰基-2-萘酚的合成［J］.精细化工，2014，31（1）：110-112.

Inhibition Effects of Hydroxy 2-substitutited Naphthoquinone Derivatives on Hep3B

Liu Ren，Jiang Xueyuan，Wu Dandan，Jin Chenghao，Shen Guinan
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Life Science and Technology College，Daqing 163319）

Naphthoquinones had been widely reported the antitumor effects.5 alkylated naphthoquinone derivatives were synthesized starting from 1，5-dihydroxynaphthalene through a five-step sequence.Four of the derivatives（6a，6b，6c and 6d）contained hydroxyl group at the alkyl terminal and one derivative（6e）had no hydroxyl group.These compounds’structures were determined by1H NMR and Mass spectrometry and were evaluated the inhibition activity on human hepatocarcinoma Hep3B cell line by MTT assay.Results suggested that such 5 compounds had definite anti-tumor ability on Hep3B human hepatomcarcinoma.The length of hydroxyl alkyl affected the inhibitory activity.Compound 6 d showed the strongest inhibition effect with IC509.1 μmol·mL-1.

naphthoquinone derivative；Hep3B；anti cancer；inhibition

TS264.2

A

1002-2090（2017）04-0087-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.019

2016-06-30

2012年黑龙江八一农垦大学校级大学生创新创业训练计划项目资助。

刘仁（1990-），男，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院2014级硕士研究生。

申贵男，男，讲师，博士后，E-mail：gns1980@163.com。