金佛山方竹根际土壤中优势AM真菌的鉴定

叶文兰，骆礼华，严 璐，姚刘斌，江 龙

(贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

金佛山方竹根际土壤中优势AM真菌的鉴定

叶文兰，骆礼华，严 璐，姚刘斌，江 龙

(贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

从贵州省正安县、桐梓县和重庆市南川区的金佛山方竹林地采集方竹根系和根际土壤，采用碱解离-酸性品红染色法对根样进行染色，研究根系丛枝菌根侵染情况，利用湿筛倾注-蔗糖离心法从土样中分离AM真菌孢子，结合形态特征和18S rDNA AML1-AML2区序列的系统发育分析对AM真菌进行种属鉴定。结果显示：AM真菌能够侵染金佛山方竹根系，侵染率为25.27%；从土壤中分离得到6种优势AM真菌，其中4种通过形态特征和18S rDNA AML1-AML2区序列的系统发育分析，均能鉴定到种水平，分别为蜜色无梗囊霉Acaulosporamellea、珠状巨孢囊霉Gigasporamargarita、美丽盾巨孢囊霉Scutellosporacalospora和孢璧两性球囊霉Ambisporaleptotich，其余2种通过18S rDNA AML1-AML2区序列的系统发育分析鉴定为无梗囊霉属Acaulospora，结合形态特征鉴定为大型无梗囊霉Acaulosporacolossica和疣状无梗囊霉Acaulosporatuberculata。

金佛山方竹；AM真菌鉴定；优势菌种；发育分析

金佛山方竹(Chimonobambusautilis(Keng) Keng f.)属于禾本科竹亚科寒竹属植物，是我国特有种之一，仅分布于贵州大娄山系海拔1 300 m以上雨雾多、湿度大、气候寒冷的高寒地区，金佛山方竹可笋材两用，竹笋营养丰富、味美鲜嫩，竹材是造纸、竹器编制的好原料，具有“竹类之冠”的美誉[1-2]，其经济价值在市场上具有巨大的潜力。前期我们在金佛山方竹林地的调查工作中发现，金佛山方竹根系有丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza，AM)，丛枝菌根是由AM真菌与植物形成的互惠共生体，通过共生体AM真菌能够促进植物对矿质元素(N、P、K)和水分的吸收，从而能够促进植物生长，提高植物的产量和品质，增强植物抗逆和抗病性[3-4]。

由于金佛山方竹林的立竹密度、繁殖和丰产栽培等技术还不完善，导致竹笋资源满足不了市场需求[5-6]，获得高产、优质的金佛山方竹笋是解决市场供需矛盾的关键。本研究以金佛山方竹主要分布区贵州省正安县、桐梓县和重庆市南川区为采样地，采集根系和根际土壤，研究金佛山方竹菌根侵染状况，从根际土壤中分离AM真菌孢子，通过形态特征和分子生物学技术相结合的方法，对金佛山方竹根际优势AM真菌进行种属鉴定，以期为进一步研究接种AM真菌对金佛山方竹产量、品质、繁殖率、移栽苗成活率等的影响提供菌种资料和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 根系和土壤样品的采集

2015年10月、2016年7月从金佛山方竹主要分布地(贵州省正安县新州镇、桐梓县狮溪镇和重庆市南川区金山镇)共采集18份金佛山方竹根系和根际土壤。采样地分布在海拔1 500～1 800 m，每隔约50 m海拔高差，选取长势良好的金佛山方竹进行采样，采样时除去杂草和表面2 cm厚土壤和杂质，从东南西北4个方向采集距地表5～20 cm土层中金佛山方竹根系(粗度小于20 mm的须根)和根际土壤，3株重复，混合后约1 kg为1个样。在采集袋上标记样地编号、海拔和经纬度。样品根系及时用清水洗净后，放进广口瓶中用固定液(FAA)固定，根际土壤于通风处自然风干后，与根系一同保存于4 ℃冰箱。

1.2 根系菌根侵染状况观察和侵染率测定

实验采用碱解离-酸性品红染色法[7]。从FAA固定液中取出根系，用清水冲洗2-3次，将根系剪成1 cm，加入10% NaOH在90 ℃水浴锅中解离1 min，水洗3-5次。加入30%过氧化氧在90 ℃水浴锅中酸化30 s～1 min，水洗3-5次。0.01%的酸性品红乳酸甘油染色2 d，染色根段置于OlympusBX53光学显微镜镜检，观察记录各种菌根结构(菌丝、丛枝和泡囊等结构)，凡是有上述结构之一的的根样，均视为有AM真菌侵染。

每个样品处理50条根段，按根段频率标准法[8]测定菌根侵染率，即没有菌根结构的根段其侵染率为0%，整条根段全被侵染的为100%，只有一半长度的根段被侵染的为50%，以此类推，并记录各侵染率下的根段条数。侵染率计算公式如下:

侵染率=∑(0%×根段数+10%×根段数+20%×根段数+…+100%根段数)/观察的总根段数。

试验数据统计分析采用 Excel 2003、SPSS 20统计软件。

1.3 AM真菌的形态鉴定

金佛山方竹土壤中AM真菌孢子的分离采用湿筛倾注-蔗糖离心法[9]，将分离的孢子收集于培养皿中，置于体视显微镜下，根据孢子的形状、大小、颜色及连孢菌丝的形状、大小进行初步分类，选取分离频度﹥50%的AM真菌孢子，用无菌枪头吸取单个孢子于载玻片上，加入载浮剂PVLG置于光学显微镜下记录孢子的形状、大小、颜色，孢壁的构造、层次、颜色、厚度，孢子表面纹饰、连孢菌丝以及压破孢子后与Melzer′s试剂染色反应等特征，依据《VA菌根真菌鉴定手册》[10]和NVAM(http://invam.wvu.edu/)网站提供的图片及菌种的描述，根据分类系统 Phylogeny and taxonomy of glomeromycota(http://www.amf-phylogeny.com/)进行种属鉴定。

分离频度(frequency，F)=(AM真菌某属或种的出现土样数/总土样数)×100%；

优势度按分离频度来划分，分离频度﹥50%为优势属(种)[11]。

1.4 AM真菌18s rDNA序列的系统发育分析

参考董秀丽和赵斌[12]描述的方法，分别提取优势AM真菌单个孢子的DNA进行巣式PCR扩增。

第一次PCR扩增：采用真菌18S rDNA通用引物对GeoA2-Geo11[13](表1)。反应体系(20 μL)：10×PCR缓冲液(mg2+plus)2.0 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)1.6 μL，DNA模板2 μL，引物 GeoA2(10 mmol·L-1)和引物Geo11(10 mmol·L-1)均为0.5 μL，TaKaRaTaq(5×16.67 mkat·L-1)0.1 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，循环30次，最后72 ℃延伸10 min。

第二次PCR扩增：采用AM真菌特异性通用引物对AML1-AML2[14](表1)，模板以第一次PCR产物稀释10倍，取2 μL，反应体系与第一次PCR相同，反应程序退火温度改为50 ℃，延长时间为50 s，其余反应成程序与第一次相同。取扩增产物2 μL，用1.0%琼脂凝胶电泳检测。

PCR产物寄到华大基因公司测序。测序得到的序列用Bioedit软件人工校对后分别提交GenBank，获取登录号，经BLAST比对后下载相似性达97%的序列，以Vanrijapesudolonga(AB051047.1)作为外群，用生物学软件MAGA 5.2通过邻位加入法(N-J)，运行1 000次bootstrap验证，构建系统发育树。

表1 Nested PCR引物

2 结果与分析

2.1 金佛山方竹根系AM真菌的侵染状况

通过根系染色，3个地区所采根系样品均观察到各种菌根结构(表2和图1)，菌根侵染率：正安县为25.33%，桐梓县为23.83%，南川区为26.67%，3个地区的侵染率都比较接近，在20%～30%之间，无显著差异，3个地区的平均侵染率为25.27%。

表2 不同采集地的根系侵染状况

注：同一列中，小写字母“a”表示差异没达到5%显著水平，“+”表示观察到此结构。

Note：in the same column,lowercase letters “a” indicated the difference did not reach significant level 5%, "+" indicates that the structure is observed

2.2 金佛山方竹优势AM真菌的形态特征

从金佛山方竹根际土壤中分离得到编号为JFAM-1～FAM-6的6种分离频度﹥50%的AM真菌孢子，JFAM-1的分离频度为72.22%，JFAM-2为83.33%，JFAM-3为55.56%，JFAM-4为61.33%，JFAM-5为83.33%，JFAM-6为66.67%，根据分离频度，它们为金佛山方竹优势菌种，经形态鉴定为以下6种AM真菌(表3和图2)。

图1 金佛山方竹根系丛枝菌根结构Fig.1 Arbuscular mycorrhizae structures in the roots of Chimonobambusa utilis1.根外孢子 ；2.丛枝和入侵点；3.根外菌丝；4. 根内菌丝及孢子；5、6.囊泡1.Extraradical spores; 2.Arbuscular structures and intrusion point; 3.Extraradical hyphae; 4.Intraradical hyphae and spore; 5，6.vesieular

图2 金佛山方竹优势AM真菌孢子的形态Fig.2 Morphology of the dominant arbuscular mycorrhizal fungi spores in the rhizosheric soil of Chimonobambusa utilis1-2：JFAM-1(大型无梗囊霉)；3-5：JFAM-2(蜜色无梗囊霉)；6-8：JFAM-3(疣状无梗囊霉)；9-11：JFAM-5(珠状巨孢囊s霉)；12-14：JFAM-5(美丽盾巨孢囊霉)；15-16：JFAM-6(孢璧两性球囊霉)1-2:JFAM-1 (Acaulospora colossica); 3-5：JFAM-2 (Acaulospora mellea); 6-8：JFAM-3 (Acaulospora tuberculata) 9-11:JFAM-4 (Gigaspora margarita); 12-14：JFAM-5 (Scutellospora calospora); 15-16:JFAM-6 (Ambispora leptoticha)

表3 优势AM真菌的主要特征

2.4 金佛山方竹优势AM真菌的18S rDNA AML1-AML2区序列的系统发育分析

以6种优势AM真菌的单个孢子DNA为模板，以引物GeoA2-Geo11进行第1次PCR扩增，由于AM真菌DNA拷贝数低，在琼脂糖凝胶中未观察到相应的AM真菌的DNA条带，以AML1-AML2为巣式引物进行第2次PCR扩增，AM真菌相应DNA序列被特异性地扩增出来，片段大小约为800 bp(图3)。

图3 18S rDNA AML2-AML2区域扩增结果Fig.3 Amplication production of the AML1-AML2 region sequenceM:DL 2 000 bp maker; 1:JFAM-1; 2:JFAM-2; 3:JFAM-3; 4:JFAM-4; 5:FAM-5; 6:JFAM-6

所用序列明显地分为4个聚类群(图4)。JFAM-1、JFAM-2、JFAM-3同在分类群Acaulospora里，JFAM-4、JFAM-5、JFAM-6分别在分类群Gigaspora、Scutellospora、Ambispora里。根据系统发育分析，JFAM-1～JFAM-6的鉴定结果如表3，JFAM-2、JFAM-4、JFAM-5、JFAM-6的分子鉴定结果与形态鉴定一致，分别为蜜色无梗囊霉Acaulosporamellea、J珠状巨孢囊霉Gigasporamargarita、美丽盾巨孢囊霉Scutellosporacalospora、孢璧两性球囊霉Ambisporaleptoticha，JFAM-1和JFAM-3在分子上鉴定为无梗囊霉Acaulospora和Acaulosporasp，与形态鉴定不一致，JFAM-1和JFAM-3在形态上分别鉴定为大型无梗囊霉Acaulosporacolossica和疣状无梗囊霉Acaulosporatuberculata，由于两者的18S rDNA序列信息在Genbank中未搜到，据现有序列信息分析，JFAM-1和JJFAM-3通过18S rDNA AML1-AML2区序列的系统发育分析只能鉴定为无梗囊霉属Acaulospora。

图4 基于18S rDNA AML1-AML2区序列的金佛山方竹根际土壤优势AM真菌的系统发育树(N-J)金佛山方竹根际土壤优势AM真菌DNA序列Fig.4 Neighbor-joining consensus phylogram for AML1-AML2 region of 18S rDNA sequence of of the dominant arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizosheric soil of Chimonobambusa utilis sequences of of the dominant arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizosheric soil of Chimonobambusa utilis

表4 金佛山方竹根际土壤优势AM真菌分子鉴定与形态鉴定

4 讨论

本研究通过对金佛山方竹根系进行染色观察发现，在各采样地样品中均能观察到各种菌根结构，如孢子、菌丝、丛枝和泡囊等结构，AM真菌能够侵染金佛山方竹根系。3个采样地的侵染率无显著差异，都在20%～30%，3个采样地的平均侵染率为25.27%，与生长在干旱地区的植物如栌橘[15]、沙蒿[16]、胡杨和骆驼刺[17]相比，金佛山方竹菌根侵染率不高。不同植物之间菌根侵染率的差异除了与植物和AM真菌的亲和程度有关，还与其生长的各种环境因子相关[18-19]。金佛山方竹侵染率不高的主要原因可能是金佛山方竹生长在湿度较大的环境中，研究表明，土壤湿度对AM真菌侵染影响很大，在含水量过高的土壤中，其侵染率明显减少[20]。虽然在自然条件下金佛山方竹菌根侵染率不高，但它仍属于菌根型植物，通过人为接种与之相匹配的AM菌种，其侵染率会有所提高。因此通过接种AM真菌在提高金佛山方竹产量、品质、繁殖率，移栽苗成活率等应用上仍具有广阔的前景。

AM真菌分类鉴定有助于菌种保存，菌种多样性研究，对于AM真菌资源在农业、造林、园艺等方面的运用具有重要的意义。AM真菌种类的鉴定常用的方法是形态鉴定法。但形态鉴定法存在一定的局限，即同一种AM真菌的形态特征会因生活史、宿主植物、地理环境的不同而出现形态差异，常常误判，造成不同研究者的鉴定结果差异很大[21]。近年来，随着分子生物学的不断发展，核酸生物信息已运用到AM真菌的分类鉴定中，使菌种鉴定更加精准，在一定程度上改变了形态鉴定的局限性[22]。

关于AM真菌的分子鉴定，国外已有报道，国内则研究得少[23]，本研究是国内首次结合传统孢子形态鉴定方法和现代分子生物学技术对金佛山方竹AM真菌进行双重鉴定，克服了孢子形态鉴定的片面性，提高了试验结果的真实性。编号为JFAM-2、JFAM-4、JFAM-4、JFAM-5、JFAM-6的4种AM真菌孢子，利用AML1-AML2区的系统发育分析鉴定为蜜色无梗囊霉Acaulosporamellea、珠状巨孢囊霉Gigasporamargarita、美丽盾巨孢囊霉Scutellosporacalospora、孢璧两性球囊霉Ambisporaleptoticha，与基于孢子形态特征的鉴定结论一致。FAM-1和JFAM-3通过形态特征，分别鉴定为大型无梗囊霉Acaulosporacolossica和疣状无梗囊霉Acaulosporatuberculata，通过AML1-AML2区的系统发育分析，两者均为无梗囊霉属Acaulospora，但未确定种名，这是因为在GenBank中没有大型无梗囊霉Acaulosporacolossica和疣状无梗囊霉Acaulosporatuberculata的基因信息，而我们试验中得到的基因信息将有望成为以上2种AM真菌在GenBank的标准信息。研究结果也证实：以AML1-AML2为巢式引物对AM真菌DNA进行巣式PCR扩增的技术，具有很好的灵敏性，简单破碎孢子或根段的粗提DNA样品就可以直接用于PCR反应，有效的扩增出目标片段，实现了AM真菌在根内和土壤中的特异性检测。可以预见随着AM真菌基因信息数据库的充实，在AM真菌的种属鉴定中，此方法将会越来越具有优越性。

AM真菌在一定的生境下长期生长发育，适应生境的菌种可大量繁殖形成优势菌种，反之则逐渐被淘汰[24]。大型无梗囊霉Acaulosporacolossica、蜜色无梗囊霉Acaulosporamellea、疣状无梗囊霉Acaulosporatuberculata、珠状巨孢囊霉Gigasporamargarita、美丽盾巨孢囊霉Scutellosporacalospora和孢璧两性球囊霉Ambisporaleptoticha可能适应这种雨雾多、湿度大、气候寒冷的高寒地区，而成为金佛山方竹根际优势菌种，这与它们自身的生物学特性有关，相关生理学和分子机制有待进一步研究。本研究报道的金佛山方竹根际优势AM真菌，可为下一步发展金佛山方竹栽培技术提供理论基础。

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Identification of the Dominant Arbuscular Mycorrhizal Fungi in the Rhizosphere Soil ofChimonobambusautilis

YE Wen-lan,LUO Li-hua,YAN Lu,YAO Liu-bin,JIANG Long

(College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,Guizhou,China)

The root samples and rhizosphere soil ofChimonobambusautiliswere collected fromChimonobambusautilisforest of Zhengan county and Tongzi county of Guizhou,and Wansheng District of Chongqing City. The infection situation of Arbuscular mycorrhizal fungi(AMF) was studied by alkaline lysis and acid fuchsin stain,and the spores of AMF were isolated by wet-sieving and sucrose density gradient centrifugation methods and the species were identified based on morphological characters and phylogenetic analysis of AML1-AML2 region of 18S rDNA sequence. The results indicated that AMF can infect the roots ofChimonobambusautilis,and the infection-rate was higher than 20%. The six dominant AMF species were isolated from the soil sample,of these,four species were identified by using both morphological characters and phylogenetic analysis of AML1-AML2 region of 18S rDNA sequence,includingAcaulosporamellea、Gigasporamargarita、ScutellosporacalosporaandAmbisporaleptotich. Another 2 were identified asAcaulosporacolossicaandAcaulosporetuberculatabased on morphological characters，and were belong to the genusAcaulosporaby phylogenetic analysis AML1-AML2 region of 18S rDNA sequence.

Chimonobambusautilis; Identification ofarbusularmycorrhizalfungi; The dominant species; Phylogenetic analysis

2016-10-18

国家科技支撑计划项目(2015BAD04B0204)，贵州省科学技术基金项目(黔科合J字〔2009〕2282号)

叶文兰，硕士研究生，从事植物学生理学等研究。通信作者：江龙，博士，教授，从事植物生理学、菌根生物学等研究。E-mail：jianglonggy@sina.com