近红外光谱法预测紫花苜蓿草捆的营养品质和消化率

薛祝林，刘 楠，张英俊

（中国农业大学草地研究所，北京100193）

随着我国规模化、标准化奶牛产业的快速发展，对高品质饲草料的需求量将越来越大，且牧草品质的优劣与畜产品质量的好坏密切相关。苜蓿（Medicagosativa）、燕 麦（Avena.sativa）、羊 草（Leymuschinensis）、黑麦草（Loliumspp.）等优良牧草品质的优劣和消化率的高低能够很大程度上影响到畜牧业的发展，如草产品的生产、流通及动物生产性能等。苜蓿作为世界上广泛种植的牧草［1］，推广、利用及评价其营养品质与饲用价值就显得尤为重要［2］。

由于传统实验室方法检测牧草化学成分需要周期较长、耗费劳动力且成本高，尤其在大批量样品测定和育种材料筛选时受到一定的限制［3］。近红外反射光谱技术（near infrared reflectance spectroscopy，NIRS）以其分析速度快，不需要化学试剂，减少环境污染，数据重现性好，成本低，易于在线分析等特点被广泛应用［4］。NIRS在国内外广泛用于农牧产品和食品中的蛋白质、水分、脂肪、淀粉等营养成分的快速检测［5］，草地植被氮素含量估测［6］，粗饲料品质检测及分级指数的在线分析等［7］。以往的营养价值参数研究主要集中于局部地区采集样品，建立定标模型，且预测指标主要为常规营养成分，纤维素、能量和消化率方面鲜有报道。本研究的意义在于寻求和建立适合中国苜蓿主产区干草草捆的近红外预测模型，探讨利用NIRS预测苜蓿草捆营养品质、能量和消化率等方面的可行性，建立快速、高效的近红外预测模型，促进畜牧业的发展。

1 材料与方法

1.1 取样设备

使用C60美国贝斯特取样器，一个锋利的，长度90cm，直径约为1.90cm中空金属装置，取样器手柄底端附带可充电池。

1.2 材料来源

分别于黑龙江、内蒙古、甘肃、宁夏、河北、山东等苜蓿主产区共6省份23个采样点，采集不同品种、茬次、生育期、管理水平的苜蓿干草草捆样品，共采集14个苜蓿品种229份干草样品。

1.3 苜蓿干草草捆取样方法

取样原则：取样时应严格按照取样计划，遵循取样操作规程及取样的代表性和随机性原则，多点取样。取样器顶端的切割面与取样器的轴成90度，于草捆两端扎口线之间取样，避开草捆边缘15cm以上，垂直钻入草捆中40cm深度钻取样品，选取20捆以上，每捆一芯，采20芯代表一批干草；对于大批次的干草（100～200t）或者具有高差异性的干草，抽取35芯［8］。取样结束后将混合的20个取芯样品，放在密闭性能良好的聚乙烯塑料袋中，在低温、避光、隔热条件下保存。

1.4 化学成分测定方法

粗蛋白（CP）采用凯氏定氮法GB/T6432-94；粗脂肪（EE）采用索氏抽提法 GB/T 6433-94；粗灰分（Ash）按照GB/T6438-92方法；中性洗涤纤维（NDF）参照GB/T20806-2006方法；酸性洗涤纤维（ADF）按照NY/T1459-2007；酸性洗涤木质素（ADL）按 GB/T20805-2006；钙（Ca）采用高锰酸钾滴定 法（GB/T6436-2002）；磷（P）采用分光光度法（GB/T6437-2002）。每个试样取两个平行样测定，取平均值。根据苜蓿干草捆样品的CP，ADF，NDF值，计算各样品的代谢能（Metabolizable Energy，ME），DMI［9］，DDM，RFV［10］值。各值预测模型如下：

1.5 消化率的测定

选用5头日粮一致且装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛，作为瘤胃液供体动物。瘤胃液于晨饲前1h内采集，经4层纱布过滤后等体积混匀，置于39℃恒温水浴锅中备用。方法参照庞德公等［11］，使用移液器向各瓶中加入50mL pH 6.85的缓冲液［12］，预热至39℃，之后向发酵瓶中接入瘤胃液25 mL，通入氮气3～5s以驱除空气后，立即盖上胶塞并旋紧瓶盖进行发酵，所有发酵瓶在恒温生化培养箱中连续培养48h后，使用200目尼龙袋收集残渣，测定苜蓿DM 消化率（IVDMD）、NDF消化率（NDFD）、ADF消化率（ADFD）。

1.6 近红外预测模型的建立

1.6.1 主要仪器与软件 使用FOSS公司的NIR System5000近红外光谱分析仪。工作参数：波长范围，1100～2500nm；波长间隔2nm，每个样品重复装样及扫样3次，取平均值，并转化为log1/R形式记录光谱数据。定标软件为WinISIⅢ；工作条件：室温25℃稳定。

1.6.2 模型的建立与验证 将样品均按3∶1随机分为定标集和验证集［13］。使用 WinISIⅢ软件，采用改进的偏最小二乘法（MPLS），结合散射处理、导数、平滑等不同的光谱预处理和数学处理方法，用定标集样品建立模型。建模时用全局距离（GH）、“X”和“T”检验对光谱异常值进行剔除；当GH≥10，X≥10和T＞2.5时，则被认为是光谱值超常样品，剔除。模型内部采用交叉验证，防止过拟合现象。根据定标标准偏差（SEC）、交叉验证决定系数（1-VR）、交叉验证标准误差（SECV）、预测标准误差（SEP）等指标评价，确定最优模型［14］。验证集样品对最优模型进行外部验证，评价其外部预测能力［15］。最后，用交叉验证相对分析误差RPDCV和外部验证相对分析误差RPDP对模型进一步评价［16］：RPDCV 和 RPDP大于3，说明定标效果良好，建立的模型可以用于实际检测；2.5≤RPD＜3，表示模型满足以筛选牧草品质为目的粗略分析；RPD＜2.5，说明该模型的预测精度有待进一步提高。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿营养成分化学分析结果

苜蓿定标集、验证集的常规营养成分分析结果如表1所示。以绝干物质为基础，定标集苜蓿的CP，NDF，ADF，DM，Ash，EE，Ca，P含量的大小范围分别为13.72%～22.23%，29.05%～61.89%，23.06%～50.37%，90.77%～93.91%，6.95%～17.80%，0.63%～2.67%，0.74%～3.10及0.10%～0.28%，平均含量分别为17.41%，47.68%，39.15%，92.16%，10.72%，1.46%，1.66%，0.20%。标准差分别为2.20%，6.85%，5.42%，0.57%，2.07%，0.41%，0.46%，0.048%，其 中NDF的标准差最大，达到6.85%，ADF标准差次之为5.42%，其次为CP标准差（2.20%），这说明牧草样品的NDF，ADF，CP在很大程度上受物候期，品种和管理水平的影响。验证集所有样品的CP，NDF，ADF，Ash，EE，Ca，P含量的大小范围均介于定标集之间。

表1 定标集和验证集样品成分化学分析结果Table 1 Chemical analyzing results of calibration and validation samples

由表2可知，ME含量的标准差最小，定标集和验证集分别仅为0.32%和0.40%。RFV的偏差最大，定标集和验证集分别可达28.25%和27.65%，定标集和验证集的大小范围分别为79.37%～227.11%和83.91%～210.38%，校正集和验证集中最小值、平均值、最大值和标准差都比较接近，样品间变异幅度较大，很大程度上可以覆盖可能出现的RFV变化范围，样品具有较强的代表性。

表2 纤维素、消化率和能量分析数据Table 2 Chemical analyzing results of cellulose，digestibility and ME

2.2 紫花苜蓿营养成分模型的建立与评价

不同化学成分相关的含氢官能团类型或含量不同，光谱吸收就会有差异，建模的光谱处理方法和参数设置也就不同［17］。本试验利用 WinISIⅢ定标软件，采用改进的MPLS，结合不同光谱处理和数学参数设置，对定标集样品建模，观察统计数据列SECV和1-VR值的高低，找出SECV值最低，1-VR值最高的模型，即为筛选出的最佳模型，建立的模型效果衡量指标采用RPDCV。由表3结果可知，RFV，NDF的RPDCV值最高分别为4.54和4.34，CP和ADF的RPDCV值均高于3，说明RFV，NDF，ADF和CP的模型能用于实际含量的分析。此外，Hemicellulose和IVDMD的RPDCV值介于2.5～3之间，说明两者的模型能够用于粗略分析，需要对定标集样品进一步扩充和完善以提高预测的准确度。反之，其他指标的RPDCV值均低于2.5，预测效果较差。

表3 化学成分模型参数Table 3 Results of spectrum treatment parameters by MPLS models

2.3 模型的外部验证

校正模型建立后，采用外部验证的方法用验证集样品对模型的预测效果进行验证，通过RSQ，SEP，RPDP评价模型实际预测效果，进一步检验其优劣。外部验证结果表明，预测值与牧草RFV化学值的预测决定系数最高达0.935，其次是NDF预测决定系数为0.932，CP为0.918，此外ADF，Hemicellulose，IVDMD的预测决定系数范围介于0.79～0.87之间；RPDP值与预测决定系数呈相似趋势，说明预测模型的预测准确性较高，可用近红外光谱技术预测苜蓿中RFV，NDF，ADF和CP的含量。NDFD和ADFD的预测相关系数最低，预测模型对这些指标的预测效果较差（表4）。

表4 验证集样品评价定标模型预测结果Table 4 Results of validation samples to evaluate MPLS models

3 讨论

近红外光谱技术作为一种间接测量方法，其预测模型的优劣往往会受到诸多因素影响，其中包括仪器的性能和工作条件、定标样品的数量和代表性、粉碎粒径及均匀度、化学分析值的误差大小以及光谱处理方法等都会对结果造成影响［18］。应用NIRS技术快速评价牧草的营养价值是配制动物日粮的关键［19］，苜蓿作为优质的粗饲料因其营养丰富，适口性好，家畜采食量高而在全世界被广泛种植，国内外众多学者对此进行了大量研究，且取得了比较满意的成果。

早在1976年Norris以苜蓿、高羊茅（Festuca arundinacea）和雀麦草（Cynodondactylon）为研究对象，预测了 CP，ADF，NDF，ADL，IVDMD 和DMI［20］。Gislum［21］等成功建立了多年生黑麦草和紫羊茅的CP含量预测模型，取得了很好的预测效果，预测值与化学值的相关系数在0.97～0.98之间。Dale应用NIRS建立苜蓿CF，NDF，ADF含量预测模型，相关系数介于0.93～0.95之间，且RPD均大于4.0［22］，这与本试验结果相似，NDF和ADF的RPDP值分别为4.18和3.02。石丹［23］等首次建立了适合中国北方的羊草干草NDF和ADF预测模型，这对于羊草品质的快速评价、准确筛选具有重要意义。陈鹏飞［24］等研究表明，青贮苜蓿 DM，ADF，NDF和CP均能准确预测，发酵品质除乙酸和丁酸预测较差外，其他指标如铵态氮、pH和乳酸预测效果较好；聂志东［25］建立了紫花苜蓿干草和羊草常规养分含量的预测模型，均取得了良好的预测效果。许瑞轩［26］等研究了田间快速估测苜蓿鲜草品质对于适时刈割的意义，结果表明DM，NDF，ADF模型可以进行粗略的定量分析，且满足田间快速估测的要求。

本试验采集了来源于不同产区、不同生育期及不同品种的苜蓿干草样品，样品分布范围较广，化学成分含量变异较大，具有较强的代表性，且所有的试验样品采取统一的干燥、粉碎和装样等前处理方式和化学分析方法，以消除系统误差的影响。RFV，NDF，CP，ADF等的 RPDCV 值均高于3，说明NIRS技术能够用于这些指标的实际含量分析。

牧草中的营养成分是评价其营养价值的主要指标，但含量的高低不能反映被家畜消化、代谢和利用的程度。研究牧草的营养物质消化率，分析牧草被家畜利用状况，能够更深层次地判定牧草的实际营养价值［27］。胡超等应用NIRS技术，采用不同的回归算法和光谱预处理方法，建立了菊苣IVDMD的预测模型，IVDMD预测值与化学值的相关系数达到0.95，结果表明NIRS预测菊苣IVDMD是可行的［28］。严旭等的结果与此类似，NIRS能够对老芒麦IVDMD进行准确分析，预测相关系数大于0.94，RPD为6.62［29］。本试验中，IVDMD 的 RPDP 为2.51，能够用于日常分析，但是NDFD和ADFD预测不成功，这主要是由于该试验中苜蓿干草样品是在体外发酵培养，瘤胃液活性受动物个体、年龄、身体状况等方面的影响［30］，并对试验误差的放大效应所致。Brogna［31］等研究了定标集样本数共316、验证集299的意大利苜蓿干草的NDFD的预测模型，结果表明NIRS能够对意大利苜蓿NDFD进行准确预测，进一步说明NIRS准确性的高低取决于足够多的样本数量且能够代表样本整体的差异性，涵盖品种、年际间、生长条件、收获时期、干燥方式等方面的差异性。

牧草可提供能值的高低也是评定其营养价值的主要依据［32］。牧草中营养物质的组成及其消化率均可导致能值的不同［33］。Krachunov［34］利用 NIRS预测苜蓿中ME的含量，SEC和SEP分别仅为0.20和0.24。本试验中ME的SEC和SEP分别为0.16和0.28，RPDCV和RPDP均低于2，预测效果较差，一方面可能由于ME最大值与最小值偏差较小；另一方面由于ME是通过ADF和CP化学值计算而得，计算结果很大程度上依赖于各自化学值的准确度，误差受到不同指标测定步骤的增加而累积，导致ME误差随着计算公式进一步扩大［35］。

本研究中对DM，EE，Ash，Ca，P等的预测效果较差这一结论与李洁等研究结果一致［36］，除样品间差异性较小、实验室测定误差较大等原因之外，样品中这些成分在生物体内的含量少，灵敏度低，矿物质与近红外光谱反映的有机物结构信息关系较差等均会导致预测效果较差［37］。

4 结论

本研究采集了我国苜蓿主要产区的干草草捆样品，探讨了利用NIRS技术建立苜蓿营养品质及消化率的预测模型，其中 RFV，CP，NDF，ADF，IVDMD等预测结果良好，可用于苜蓿的快速评价和实际含量分析；但是矿物质元素、脂肪等低灵敏度成分的含量，仍需沿用传统检测方法，或进一步对预测模型进行优化。后续应扩大取样范围并加强年际间苜蓿样品的收集，对模型进行持续的维护和更新；还需要筛选结果重现更佳的能量和消化率检测方法，降低化学测定的误差，从而实现苜蓿草产品品质的精准预测与广泛应用。