20个高羊茅品种镉耐性评价及富集特征

王宝媛，濮阳雪华，宋桂龙＊，周述琼，赵克奇，蒋 凯

（1.北京林业大学草坪研究所，北京100083；2.深圳市铁汉生态环境股份有限公司，深圳518040）

生活垃圾、化肥和农药的使用以及化工、医药、 制造及开采业的发展等，造成了土壤重金属的污染［1］。镉是化学活性和生物毒性较强的重金属元素，长期存留在土壤中，极易被植物吸收积累进入食物链，是对人类健康威胁最严重的重金属之一［2］。因此必须采取有效的技术和措施将其固定或提取。植物修复具有成本低、可持续和原位无污染等特点，是治理镉污染土壤的重要手段。但是现有的镉超富集植物普遍存在生物量小，繁殖性差等缺点，很难在镉污染地治理的实际中应用。因此，抗镉、富集镉、生物量大、可多次收获的植物材料对于生态修复尤为重要。

高羊茅（Festucaarundinacea）作为优良的冷季型草坪草，生物量较大，可多次修剪，观赏性强，对重金属有一定的吸收和耐受能力，为其用于修复重金属污染的土壤以及恢复土壤生态系统的自净功能提供了可能［3］。相关研究表明，植物在耐受和富集重金属能力上，不仅表现出显著的种间差异，也表现出了显著的种内差异即基因型差异［4］。研究发现不同高羊茅品种在Cd2+胁迫下，植株生物性状指标与生理指标变化程度均存在很大差异［5］，相对存活率也存在显著差异［6］，说明不同品种的抗性能力和抗性机制存在差异。基于此，本文采用温室水培试验法，对Cd2+胁迫下20个高羊茅品种的形态及生理指标变化进行综合评价，并测量其Cd2+累积量，旨在筛选出对重金属镉吸收和耐受能力较好的品种，从而为进一步研究高羊茅的耐镉机理和高羊茅在生态修复实践中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以国内收集到的20个高羊茅品种（表1）为试验材料。品种发芽率为90%～95%，纯度为95%～98%。

1.2 试验设计

育苗基质采用蛭石和草炭以1∶1比例混合，种子萌发7d后，将长势一致的幼苗用去离子水反复清洗，移入到装有1/2Hoagland营养液的水培容器（44cm×33cm×21cm的塑料箱）中，适应7d后进行Cd2+处理，Cd2+浓度为10μM（以CdCl2·2.5 H2O形态加入），处理30d后收获。营养液用0.1 M NaOH或0.3MHCI调节pH为弱酸性（5.8～6.0）。处理设3个重复，每个重复30株，每7d换一次营养液。试验于温室内进行，温室条件为：白天/黑夜温度为25/20°C，相对湿度60%～70%，光照/黑暗时间为14/10h。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 株高与根长的测定 高羊茅根系用20 mmol·L-1Na2-EDTA溶液浸泡30min，然后用蒸馏水冲洗数次，测量株高和根长，每个处理下不同品种各测10次重复，取平均值。

1.3.2 生物量的测定 高羊茅根系用20mmol·L-1Na2-EDTA溶液浸泡30min，用蒸馏水冲洗数次后将其根系和茎叶分离，烘箱105℃杀青半小时，65℃烘至恒重，分别称量茎叶干重与根系干重，每个处理下不同品种各测10次重复，取平均值。

1.3.3 光合色素含量的测定 根据张志良的方法［7］，稍有改动。称新鲜叶片0.05～0.08g，记下具体质量，剪碎后置于离心管中，加入8mL 95%的乙醇，室温下避光静置48h；于665nm，649nm，470 nm测定其吸光值。

根据公式计算：

1.3.4 Cd2+含量的测定 烘干样使用粉碎机粉碎，过60 目（0.3mm）筛后称重 0.50g，采取HNO3-HClO4（4+1）混合酸湿法消化，使用仪器为Hanon220s石墨消解仪，消化完全后定容于25mL容量瓶，采用原子吸收分光光度计（Varian Spectrum AA220）火焰吸收法测定Cd2+含量。

1.4 数据分析

考查植物在逆境胁迫下的耐受能力，通常用到的参数是耐性指数，一般情况下，是处理组的株高或根长与对照组株高或根长的比值。耐性指数越高表明植物耐受能力就越强，反之越弱。计算公式如下：

耐性指数=处理值/对照值［8］

隶属函数值计算公式［9］：

反隶属函数值计算公式

式中Xi为指标测定值，Xmin，Xmax为所有参试材料某一指标的最小值和最大值。

“眼睛周围的蓝色当然是因为涂蓝色眼影而已啊。”社长说，“这题的答案只分正常和不正常两种，涂蓝色眼影之外的答案都是不正常。”

用Microsoft Excel 2013记录所有数据，制作相关图表，SPSS 20.0进行方差、相关和聚类等分析。

2 结果与分析

2.1 Cd2+处理下20个高羊茅品种耐性差异

为了更加准确地显示高羊茅对镉胁迫的耐受能力，将与逆境胁迫处理相关的株高、根长、生物量（根系和地上部）和光合色素含量（叶绿素和类胡萝卜素）等指标相应的耐性指数一一计算、整合，用以综合评价不同品种高羊茅对镉胁迫的耐受能力，同时对各个指标的耐性指数加以排序，具体结果如表2所示。

表2 Cd2+处理下20个高羊茅品种6个指标的耐性指数Table 2 Tolerance index for six indicators of tall fescue varieties under Cd2+stress

2.1.1 Cd2+胁迫下20个高羊茅品种株高与根长差异Cd2+胁迫下20个品种的株高变化如图1（A）所示。在10μM Cd2+浓度下，20个高羊茅品种的株高均受到了显著抑制（P＜0.05），其中18号受抑制最严重，仅为对照的48.94%。由表2可知，株高的耐性指数差异性较明显，范围在0.490～0.905之间，15号植株长势相对较好，其耐性指数最大为0.905，5号次之。

图1（B）显示20个高羊茅品种的根系长度均受到显著抑制（P＜0.05），抑制长度范围为13.90～24.37cm，其中耐性指数较高的品种为2号和5号，分别是0.533和0.450，12号根长受抑制最严重，耐性指数仅为0.185，降幅达到85.51%。

从植株整体看，株高抑制程度低于根系，且表现出地上地下抑制的一致性，如5号在株高和根长上表现均较好，12号根系和株高抑制都很严重，但也有个别品种表现出根系抑制明显，而地上抑制较轻，如15号、19号、20号。从株高和根长来看，5号耐性最好，12号最为敏感。

图1 Cd2+处理对不同高羊茅品种株高和根长的影响Fig.1 Effect of Cd2+treatment on shoot and root length of different tall fescue varieties

图2 Cd2+处理对不同高羊茅品种地上生物量和地下生物量的影响Fig.2 Effect of Cd2+treatment on above ground and under ground biomass of different tall fescue varieties

2.1.2 Cd2+胁迫下20个高羊茅品种生物量差异 20个高羊茅品种Cd2+处理下地上生物量（A）和地下生物量（B）差异如图2所示。由图2（A）可知，Cd2+胁迫下，20个高羊茅品种地上生物量均有一定程度的下降，耐性指数差异较大，下降幅度范围为3.8%～64.8%，其中15号耐性最好，耐性指数达到0.962，与对照组差异不显著，8号次之，而3号受抑制比较明显，耐性指数仅为0.352。

如图2（B）所示，根系生物量最大的是8号，耐性指数为0.952，与对照组差异不显著。其他品种均显著降低（P＜0.05），12号受到明显抑制，降幅达到81.3%。仅从单个植株生物量来看，8号对Cd2+的耐性最强，3号和12号则比较敏感。

2.1.3 Cd2+胁迫下20个高羊茅品种光合色素差异 由图3可知，与对照组相比，20个高羊茅品种叶绿素含量和类胡萝卜素含量均表现出一定程度的降低，下降幅度分别在0.57%～48.2%和2%～37.5%之间。Cd2+处理对12号叶绿素含量的影响最小，耐性指数达到0.943。7号和10号的类胡萝卜素含量与对照无显著差异，表现较好，16号耐性指数最低，只有0.625。

图3 Cd2+处理对不同高羊茅品种叶绿素含量和类胡萝卜素含量的影响Fig.3 Effect of Cd2+treatment on chlorophyll content and carotenoid content of different tall fescue varieties

2.2 Cd2+处理下各指标耐性指数的隶属函数值

20个高羊茅品种在生长和生理指标上对Cd2+胁迫响应差别很大，很难用某一指标评价其耐镉性。为了全面且精确地评价高羊茅对Cd2+胁迫的耐受能力，通过模糊数学隶属函数对20个高羊茅品种的6个指标的耐性指数的隶属函数值进行综合评价，结果如表3所示，品种8号耐性最强，2号次之，16号最弱。

表3 不同高羊茅品种耐性指数的隶属函数值及综合排序Table 3 Subordinate function values of tolerance index and comprehensive ranking of tall fescue varieties

20个品种耐性指数的隶属函数值相关性分析结果如表4所示。结果表明，各指标耐性指数的隶属函数值与总隶属函数值均表现为极显著相关（P＜0.01），相关系数分别为0.769＊＊，0.664＊＊，0.774＊＊，0.716＊＊，0.587＊＊，0.686＊＊。因此，以下6个指标对于耐镉强弱的筛选均有意义。

表4 Cd2+处理下不同高羊茅品种耐性指数的隶属函数值的相关系数Table 4 Correlation coefficients of subordinate function values of tolerate index of different tall fescue varieties under Cd2+treatment

2.3 20个高羊茅品种Cd2+吸收特征

2.3.1 Cd2+吸收量 20个高羊茅品种Cd2+浓度和累积量如表5所示。20个高羊茅品种地上部和根系都富集了不同浓度Cd2+，且地上部Cd2+浓度均大于100mg·kg-1，其中最高浓度为150.97mg·kg-1。此外，根系Cd2+浓度最高值为290.69mg·kg-1。冠根浓度比（S/R，地上与地下部Cd2+浓度比）显示了Cd2+由根系向地上部转运的能力。20个高羊茅品种的冠根浓度比范围在0.43～0.73之间，可见不同品种对Cd2+的运输能力也存在较大差异。Cd2+累积量代表了植物吸入体内并富集在体内的储存能力，在用植物进行污染土壤修复时，这个指标很大程度上反映了植物的修复效果。试验中总累积量最高值为6.87 μg·株-1，最低值为2.75μg·株-1。综合来看，8号和15号在Cd2+吸收和累积上表现较好；部分冠根浓度比较高的品种吸收量也较好，如10号，15号；但是也有个别品种冠根浓度比较高，吸收量却较差，如4号；而3号，12号的转运能力和累积能力均较弱。

表5 不同高羊茅品种的Cd2+含量及累积量Table 5 Cd2+content and accumulation of different tall fescue varieties

2.3.2 高羊茅Cd2+累积总量与耐性指数的隶属函数的聚类分析 为了在高羊茅Cd2+耐性基础上进一步筛选到Cd2+高吸收的品种，以Cd2+累积总量与各个耐性指标的耐性隶属函数值为指标进行聚类分析，将20个品种划分为4种类型，第一种定义为高耐性高吸收型，特点是耐性很强，且Cd2+吸收能力也很强，共8个品种，分别是1号，2号，8号，9号，10号，11号，15号，20号，占总数的40%。第二种定义为高耐性低吸收型，特点是耐性较强，但是Cd2+累积能力偏弱，分别是5号，7号，14号，17号。第三种定义为低耐性高吸收型，特点是耐性较弱，吸收能力较强，包括13号和19号。第四种定义为低耐性低吸收型，特点是耐性较差，吸收能力较弱，共计有6个品种被划入此类型，分别是3号，4号，6号，12号，16号，18号。各个类型的Cd2+累积总量和耐性隶属函数值覆盖的范围如表6所示。

表6 高羊茅Cd2+累积总量与Cd2+耐性指数隶属函数的聚类分析Table 6 Cluster analysis of Cd2+accumulation and subordinate function values of tolerance index of tall fescue varieties

3 讨论

重金属镉是一种有毒的非必需元素，易于被植物吸收、富集，过量的Cd2+会影响植物的正常生长发育［10］，导致植物产生外观毒害症状包括叶片萎黄、叶片坏疽、根系坏死、生长受到抑制以及产量下降等［11-14］。本试验选择10μM作为胁迫浓度，利用耐性指数对高羊茅的生长指标进行分析，结果表明20个高羊茅品种的生长发育均受到了一定程度的抑制，各指标耐性指数均小于1。

利用不同指标评价不同植物对重金属的耐受程度可能得到不尽相同的结果［15］，本研究中不同高羊茅品种各指标耐性指数存在明显差异，有些品种如‘Commander’和‘Gold Crown’的地上和地下部分均表现出较高的耐性，品种‘Super Watchdog’地上和地下部的耐性均较弱，‘Arid 3’和‘Extreme’的耐性主要表现在地下部分，而‘Red Start’的地上部分耐性表现更强。综合来看，根系长度和地下生物量两个指标的下降幅度分别为46.7%～81.5%和4.8%～81.3%。株高和地上生物量的下降幅度分别为9.5%～51%和3.8%～64.8%，说明植物在受到Cd2+胁迫时，地下部分（地下生物量和根长）对Cd2+胁迫的敏感度明显高于地上部分（地上生物量和株高），受到的伤害相对更大，这与王晓桐的研究结果一致［16］。进一步分析表明，在Cd2+胁迫下，抗性强的品种地下部分所受影响较小，如‘Arid 3’，‘Extreme’和‘Gold Crown’等，而抗性弱的品种地下部分所受影响较大，如品种‘Essential’，‘Super Watchdog’等。在叶绿素含量和类胡萝卜素含量这两个指标上，品种‘Super Watchdog’和‘Justice’表现较好，均与对照组差异不显著。单一指标难以全面准确地反映植物对重金属的耐受性强弱，隶属函数值法既可消除个别指标带来的片面性，又使材料耐性差异具有可比性［17］。本试验利用隶属函数将20个品种各个指标的耐性指数进行综合分析，总隶属函数值最高的品种为‘Commander’，耐镉性最强，‘Extreme’次之，‘Gram villa’表现最差。

用于土壤修复的理想植物应该具有高生物量，生长快速，在收获部位能忍耐并累积一定量的重金属等特征，高羊茅具备高生物量和快速生长的优点，但是仅仅筛选出耐镉品种还是不够的，还要进一步对其吸收特征进行研究以获得高耐性和高吸收的品种，所以本研究对高羊茅品种累积总量进行测定。试验结果显示，20个高羊茅品种的地上部和根系都累积了大量的Cd2+。有研究表明，Cd2+超积累植物蒲公英（Taraxacummongolicum）在100mg·kg-1Cd2+处理下其根系和地上部的Cd2+浓度分别达到了41.9和57.2mg·kg-1［18］。新发现的Cd2+超积累植物锦葵（MalvasinensisCavan）在200 mg·kg-1处理下其根系和地上部的Cd2+浓度分别为92.2和154.3mg·kg-1［29］。而在本研究中，20个高羊茅品种经过Cd2+处理30d后，在保持良好的生长状态的情况下，根系和地上部Cd2+浓度分别达到了180.39～290.69和106.66～150.97mg·kg-1，达到了超富集植物的标准（地上部Cd2+浓度大于100mg·kg-1）［20］。由此可见，高羊茅在较短的时间内，能够在体内富集较高浓度的Cd2+，且Cd2+分布格局呈现为根部＞地上部，表明Cd2+大部分被累积在植物的根部，这与王凯荣［21］等的研究结果相一致。

4 结论

20个高羊茅品种各指标耐性指数的隶属函数值与总隶属函数值均表现出极显著相关水平（P＜0.01），说明6个指标在植物耐性筛选上均有意义。因此在对高羊茅耐镉性进行初步鉴定时，株高、根长，生物量和光合色素均可作为评价鉴定参考指标。

通过综合评价分析，最终将20个品种分为4种类型，分别是高耐高吸收型：‘Arid 3’，‘Extreme’，‘Commander’，‘Escalade’，‘Ecological King’，‘Ky-32’，‘Red Start’，‘Green Label’；高耐低吸收型：‘Gold Crown’，‘Justice’，‘Honky Tonk’，‘Aries’；低耐高吸收型：‘RubyⅡ’，‘Coronado TDH’；低耐低吸收型：‘K31’，‘Crossfire III’，‘Essential’，‘Super Watchdog’，‘Gram villa’，‘Dynamic II’。其中高耐性高吸收型的8个品种更适合用于Cd2+污染的植物修复。这为进一步研究高羊茅种内耐性及吸收差异奠定了良好的基础，也为生产实践中品种的选择提供了理论依据。