酶电极中酶固定化方法的研究进展

王冕+李威

摘 要：酶修饰电极是最常用更是最早开发出来的生物传感器，而酶电极法也深受有机分析、生化分析和药物分析工作者青睐，而酶固定化作为酶电极的核心技术也一直以来受到科研人员的关注。据此，主要对酶电极中酶固定化技术这一领域近年来的研究成果进行综述。

关键词：酶修饰电极；固定化酶；研究进展

中图分类号：TB文献标识码：Adoi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2017.20.102

1 绪论

酶电极是将游离的活性酶固定在基体电极的表面，通过相应的酶促反应来对待测物的浓度进行测量，而且按照基体电极所得的不同信号可将酶电极区分为电流型和电位型两种类别。世界上第一个酶电极的诞生需要追溯到1956年Clark提出把酶与电极结合在一起的猜想，并在1962年证实了葡萄糖氧化酶与氧电极结合在一起并对葡萄糖进行检测的可行性。酶电极法因为其拥有着反应速度快、选择性好和制作简便经济的特点深受有机分析、生化分析和药物分析工作者的青睐。

酶是一种具有生物催化功能的高分子物质，化学本质是大多为蛋白质，其本身可被微生物所降解，而且酶还拥有较好的选择性和催化活性，是一种绿色而又高效的催化剂。不过游离状态下的酶对外界环境十分敏感，酶的性质不稳定，在一些极端环境下容易失活，并且蛋白质分子较小，容易在催化反应之后混入一些杂质，这让反应之后对产物的提纯造成了一定的麻烦，所以为了克服以上游离状态下的酶所出现的问题，就出现了酶固定化技术。

酶固定化是指使用材料把游離状态下活性酶限制在一定范围内，但依旧保证酶具有催化能力，而且使酶更容易被回收和可以反复利用的一种新技术。与游离状态下的酶和天然酶相比，固定化酶除了在稳定性、活力与选择性上得到了提升之外，固定化还能使酶促反应过程得到更加严格的控制同时使酶更容易与底物分开。

本文介绍了酶电极和固定化酶的一些基本信息，重点对制作酶电极的关键技术酶的固定进行了讨论。对包括吸附固定、包埋固定、共价键合固定和交联固定的传统酶固定方法和一些新型酶固定方法例如纳米技术处理、静电纺丝和磁处理进行了介绍并进一步对各种固定方法的优缺点进行了探讨。

2 传统酶固定化方法

2.1 吸附固定

吸附固定主要是通过范德华力、亲核作用和氢键等作用力，把酶固定到合适的载体上或是直接固定于电极表面。这种方法操作简单，在温和条件下即可完成固定过程，最重要的是跟其他酶固定化方法相比，这种方法没有涉及化学修饰，在很大程度上保持酶的活力，但也是因为这种方式只是单纯地使酶吸附在载体之上，使通过这种方法得到的固定化酶因为与载体相互作用较弱而极易从载体中脱落。李赛等在钛丝基体上沉积了一层纳米级的二氧化钛（TiO2）的多孔膜，再把尿素酶直接吸附在二氧化钛膜上，基于二氧化钛膜对PH的响应，制造出了一种廉价、易微型化的PH敏感的尿素酶修饰电极。李文娟等使用静电吸附的固定方法将辣根过氧化物酶固定于以氨基苯磺酸电聚合膜为基底，使用层层静电组装技术固定纳米金和多层天青Ⅰ所制备的复合薄膜上，从而制得过氧化氢酶修饰电极。该酶修饰电极1.5mmol/L的米氏常数说明在电极上所固定的酶具有较高的生物活性。

2.2 交联固定

交联固定通过让酶分子与双（多）功能交联试剂反应让酶分子内部或酶分子间发生交联，以形成不溶于水的三维交联体最后附着在固体表面而达到使酶固定的方法。这种方法的优点是所形成的生物组分的固定比较牢固，不易脱落，使用寿命较长，不过缺点是反应比较难以控制，反应中交联剂的量和溶液的pH值等各个步骤都需要小心地控制。毕春元等用戊二醛把吡喃糖氧化酶固定于醋酸纤维素载体的膜上，制备出电流型电化学酶修饰电极。测试结果表明，该酶电极对木糖和葡萄糖都有着杰出的响应特征。黄晓东等以壳聚糖作为固酶基质，以在玻碳电极上电聚合的甲苯铵蓝为电子的传递介体，以戊二醛为交联剂将葡萄糖氧化酶在真空状况下固定在被甲苯胺蓝修饰的玻碳电极表面，制成葡萄糖氧化酶修饰电极。这种酶修饰电极的选择性很好，即便在尿酸、抗坏血酸以及磷酸等一些成分浮渣的溶液中，也可以获得较为准确的数据。

2.3 包埋固定

包埋固定其实就是指将酶包埋在聚合物或是凝胶的微囊结构或者格子结构中，这种方法不仅让底物可以渗透到格子里与酶接触与其发生酶促反应，同时还可以有效地减少酶蛋白的流失。因为在包埋过程中酶蛋白一般没有发生氨基酸残基的结合反应，所以其本身的高级结构可以说没有发生任何变化，酶本身的特征也得以比较完好的保留下来，不过包埋的过程中总是伴随着化学聚合反应，这容易使酶的活性丧失，所以以包埋法固定酶需要注意反应条件，在反应的过程中应尽量避免发生化学聚合。韩恩等使用被聚二烯丙基二甲基氯化钠（ PDDA）功能化的碳纳米管采取包埋的方法将酪氨酸酶固载在玻碳电极的表面，以莠去津农药对酪氨酸酶的抑制作用为作用原理，构建了一种可以快速对莠去津农药进行检测的酶修饰电极。而谢德明等人利用壳聚糖以包埋固定的方式固定 TCNQ和乙酰胆碱酯酶到泡沫镍载体的表面，制备出 TCNQ/乙酰胆碱酯酶修饰电极，通过后期测试表明，当壳聚糖溶液和 TCNQ丙酮溶液混合比例为1.5∶1和壳聚糖溶液与乙酰胆碱酯酶溶液的混合比例为1∶1时，乙酰胆碱酯酶修饰电极的性能最好。

2.4 共价键和固定

共价键和固定法是以共价固定的方式把酶固定到契合的载体上，共价键和固定法主要有两种类型：一种是让酶上的有关基团与载体上经过活化的有关基团进行偶联；另一种则是让酶先与双功能发生偶联，再将发生偶联的双功能试剂连接到载体上，在这之中最常用的双功能试剂为戊二醛。与其他固定化酶和天然的未经过固定化的酶相比，经共价键和的固定化酶的性能如选择性、稳定性和活力都有着显著的提升。牛真真等人制备了以硫堇、纳米金和对氨基苯丙酸（4-ABA）共价键和葡萄糖氧化酶的新型酶修饰电极。这种葡萄糖氧化酶修饰电极是通过把醛基化的葡萄糖氧化酶跟硫堇和半胱氨酸以共价键和的形式层层组装于玻碳电极的表面，将氧化酶与硫堇所构造出的酶自组装多层膜当作葡萄糖的生物传感界面使用。这种方法简单易行，双层的膜电极的共价键高度稳定，纳米金粒子的加入，使电极表面酶的固载量增加，也改善了电极界面电子传递的能力，使这种酶修饰电极具有较低的检出限，而且该酶修饰电极的线性范围也有所提升。任群翔等同样利用共价键和的方法将葡萄糖氧化酶固定于基体电极表面，不过他们在固定过程中加入了石墨烯，这让电极比表面积增加，从而提高了氧化酶在基体电极表面的固载量。endprint

以上几种传统的酶固定化方法各有其优缺点，在现实的应用中，可按照实际情况和具体要求采纳此中任意一种固定化方法，有时也可以同时将两种或者数种固定化方法进行联用。马立辉等人为了实现精确而又快速地对发酵酒中尿素的含量进行检测，以明胶与壳聚糖为包埋材料，透析膜为载体，把戊二醛作为交联剂，用包埋、吸附和交联三种固定化方法联用，制作了固定化的脲酶膜，最后修饰到铵离子选择电极上，所得的酶修饰电极具备对发酵酒中的尿素进行准确而又快速测定的能力。此酶修饰电极的每片脲酶膜都可以进行多次测量，并且是可更换的，这使测量的成本降低。而且这种酶修饰可在酸性的环境下对发酵酒中尿素含量的进行快速检测，这为控制发酵酒的营养、质量以及食用安全提供了有力的技术支撑。

3 新型酶固定化方法

3.1 纳米处理

纳米技术处理是指利用酶与纳米材料相结合，制备成纳米固定化酶，因为纳米材料特殊的理化性质，使用纳米技术处理的固定化酶在酶的活性上有着很大提升，酶本身的理化性质得到了优化，在酶促反应中的速度得到提高，其稳定性也得到了改善，进而将酶利用率与生产效率提高。施赛花为了使酪氨酸酶的活性获得提高，将碳纳米管引入到酪氨酸酶膜所修饰的电极上，这一举动还加快了电极反应的速度，电极响应的强度也得到加强，这让该酪氨酸酶膜修饰电极的灵敏度比普通的酪氨酸酶膜修饰电极增大了5倍。这为在水环境中对痕量酚进行測定提供了一种灵敏、稳定又简单高效的测定方法。刘洋等将 Au/ TiO2纳米复合材料修饰于针型 Pt电极上，再将葡萄糖以戊二醛作为交联剂固定在此修饰电极之上，最后在酶电极上用5%Nafion乙醇溶液涂膜形成高分子保护膜，所制备的酶修饰电极具有可植入使用的特点。作为一种可植入器件的雏形，该酶修饰电极有望在将来发展成为有现实应用前景的临床检测装备。

3.2 磁处理

磁处理就是在固定的过程中使用具有磁响应性的材料进行固定利，这种固定方法所得到的固定化酶也具有磁相应性，只需要在外环境中给与磁场便可以简便地对酶进行回收。而磁性载体可以将磁性氧化物四氧化三铁、聚苯乙烯还有含醛基的聚合物等载体在一起溶解混合后，再将溶剂除去以此得到磁性载体，或者直接使用内部含有磁性物质的具有磁响应性的超细粉末磁性高分子微球做磁性载体。中国专利 CN101329296 A（2008）把碳纳米管超声分散到含二价和三价铁离子的壳聚糖酸水溶液里，制备出由壳聚糖、碳纳米管和四氧化三铁构成具有磁响应性的三组分纳米复合材料，然后以戊二醛作为交联剂，依靠葡萄糖氧化酶的伯氨基与其交联，将其固定到所制备的磁性纳米复合材料表面。

4 展望

最近的几十年来，酶的固定化方法因为一些新的技术和材料的加入所以得到很好的发展和完善，而且与一些传统方法固定所得到的固定化酶相比，使用新型固定化技术所制作出来的固定化酶有着更强的催化活力而且酶的性质更加稳定。但是在酶电极中酶固定法研究的现阶段，仍然有许多问题需要我们去解决，比如说大多是酶固定方法所需的条件都需要在实验室里才能达到，还不能做到大规模制备。酶固定化作为酶电极的核心技术，在此后的研究中仍然会是这个方面的研究重点和热点。研究和探索新的酶固定化技术，延长固定化酶的半衰期、提高活力回收率、优化酶固定化时所需条件和降低固定化酶的制备成本将会成为固定化酶领域今后主要的研究方向。

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