猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

徐引弟,鲁智远，王治方，李海利，张青娴,朱文豪，焦文强，郎利敏，王克领

(河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州450002)

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

徐引弟,鲁智远，王治方，李海利，张青娴,朱文豪，焦文强，郎利敏，王克领

(河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州450002)

为了建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)快速、特异的检测方法，减少猪流行性腹泻(PED)给养猪业带来的损失，根据PEDV的S基因序列设计1对引物，优化扩增条件，建立了针对PEDV的RT-PCR检测方法。结果显示，建立的检测方法可特异地检测出PEDV。应用建立的检测方法对2016年河南地区38家发生腹泻的猪场的256份病料进行检测，结果表明，阳性猪场为30家，阳性样本为157份，检出率高于试纸条检测方法。可见，建立的检测方法特异性强，可用于PEDV感染疑似病例的诊断及流行病学调查。

猪流行性腹泻； RT-PCR； 检测

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水为主要特征的一种高度接触性肠道传染病，各年龄段的猪均可发生，哺乳仔猪发病率可达100%，1周以内出生仔猪死亡率高达80%～100%。1971年首次在英国发现PED，2010年韩国首次报道PEDV的S基因发生变异。我国自2010年10月流行并暴发PED，给中国东南省份的养猪场带来了毁灭性的经济损失。从2010年10月开始，由变异PEDV引起的PED给世界养猪业造成了巨大的经济损失。在一些接种过经典弱毒株CV777疫苗的猪场也报道发生PED[1-3]。我国2010年10月暴发PED，2011—2013年疫情从蔓延到有所缓和，2015—2016年疫情有所反弹，并且预计未来 PED会继续流行，呈常态化，PEDV将继续变异和演化，不可避免会出现新毒株[4-5]。快速诊断PEDV引起的腹泻，对减少PEDV造成的损失意义重大。鉴于此，建立PEDV的快速、特异、敏感的RT-PCR检测方法，旨在为PED的防制提供保障。

1 材料和方法

1.1病料

临床病料为2016年河南地区发生腹泻的38家猪场的猪肠道内容物、粪便。猪圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)、繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性病料均由河南省农业科学院畜牧兽医研究所兽医研究室鉴定并保存。

1.2主要试剂

M-MLV反转录酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker、2×TaqMix Master、TaKaRa MiniBEST 病毒RNA/DNA提取试剂盒等均购自宝生物(大连)有限公司。PEDV快速检测试剂条购自韩国安捷公司。

1.3引物设计

参照GenBank中PEDV的S基因设计引物，上游引物PED1：5′-TTCTGAGTCACGAACAGCCA-3′，下游引物PED2：5′-CATATGCAGCCTGCTCTGAA-3′，预期扩增目的片段651 bp。

1.4病毒基因组RNA的提取与cDNA的合成

按照试剂盒说明书进行操作，提取的RNA立即使用或保存在-80 ℃。离心管中加入上述提取的RNA 5 μL、5×M-MLV Buffer 2 μL、dNTP Mixture 0.5 μL、RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.25 μL、M-MLV反转录酶 0.25 μL、RNase free ddH2O 2 μL，混匀后37 ℃水浴1 h，用于PCR扩增。

1.5RT-PCR扩增条件优化

1.5.1 RT-PCR反应条件的优化

1.5.1.1 最适模板用量 分别取1、2、3、4、5、6 μL cDNA进行PCR反应，以确定最适的模板用量。

1.5.1.2 最适引物用量 在25 μL的反应体系中，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μL上下游引物进行PCR扩增反应。

1.5.1.3 最适退火温度 分别采用53、54、55、56、57、58 ℃作为退火温度进行PCR扩增反应。

1.5.1.4 RT-PCR扩增反应 PCR反应在25 μL反应体系中进行，2×TaqMix Master 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至25 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取5 μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，观察结果。

1.5.2 RT-PCR特异性与敏感性试验 从阳性病料PCV2、PRRSV、CSFV和PRV中提取DNA或RNA，用实验室已经建立的方法分别进行扩增。将提取的PEDV cDNA经紫外分光光度计测定质量浓度，用无菌去离子水按10倍梯度分别稀释调整至100～0.001 μg/μL，分别进行扩增。

1.6河南省2016年猪流行性腹泻疑似病料检测

用建立的RT-PCR检测方法对河南省2016年发生腹泻的38家猪场共256份病料进行检测,同时用韩国安捷公司生产的PEDV快速检测试纸条进行检测。

2 结果与分析

2.1RT-PCR反应条件的优化结果

通过PCR反应条件的优化，确定最适模板量为5 μL、最适引物用量为1.0 μL、最适退火温度为57 ℃。PCR扩增结果显示，可以扩增出1条约为651 bp的PEDV的基因片段(图1)，与预期大小相符合。将扩增产物进行测序分析，结果显示，与2014年河南分离株CH/HNYF/14株(GenBank登录号KP890336)S基因同源性为99.2%。

M.DL2000 DNA Marker； 1.空白对照； 2.PEDV图1 RT-PCR扩增结果

2.2RT-PCR特异性试验结果

建立的PCR方法对PEDV可扩增出651 bp的目的基因片段，而对PCV2、PRRSV、CSFV和PRV均未扩增出目的片段(图2)。

M.DL2000 DNA Marker； 1.PRV； 2.PCV2； 3.PRRSV； 4.CSFV； 5.PEDV图2 RT-PCR特异性试验结果

2.3RT-PCR敏感性试验结果

从图3可以看出，PCR检测的灵敏度可达0.1 μg/μL cDNA。优化的反应体系在PEDV模板质量浓度为0.1～100 μg/μL时能扩增出特异性条带，在模板质量浓度为0.01 μg/μL和0.001 μg/μL时均无扩增，说明优化的反应体系对 PEDV模板的扩增下限质量浓度为0.1 μg/μL。

M.DL2000 DNA Marker； 1—6.PEDV模板质量浓 度分别为0.001、 0.01、 0.1、1、10、100 μg/μL图3 RT-PCR敏感性试验结果

2.4建立检测方法的应用

应用建立的RT-PCR方法检测河南省2016年发生腹泻的38家猪场的256份病料。结果显示，阳性猪场30家，阳性样品157份，表明河南省2016年猪场发生腹泻的PEDV阳性率较高。

同时用韩国的PEDV快速检测试纸条检测出阳性样品132份，阳性率为51.56%。

3 结论与讨论

PEDV是引起新生仔猪腹泻的主要病原，是制约养猪业发展的瓶颈。PEDV的病原检测方法有病毒的分离鉴定、抗原捕获ELISA、PCR、荧光定量PCR、免疫层析试纸条检测方法等，PEDV很难通过细胞培养来鉴定，而PCR检测方法比抗原捕获ELISA检测方法更敏感，荧光定量PCR检测方法由于设备要求和费用昂贵，应用具有一定的局限性。因此，PCR检测方法是应用最为广泛且较简便的检测方法[6]。血清学方法是另外一种有效检测猪群中PEDV抗体的手段，包括间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和中和试验(SN)等，是常用的血清学方法[7]。

本试验建立的RT-PCR检测方法相对于试纸条检测方法更加特异敏感，由于试纸条检测方法应用的是免疫层析的原理，对病料中抗原的量有一定的要求，抗原含量不足时，常出现假阴性；当病料过多，会出现假阳性和跑带缓慢，而PCR方法能检测

出病料中非常微量的病毒核酸，因此，RT-PCR方法敏感性高于试纸条方法。但由于RT-PCR方法需要RNA提取、反转录、PCR扩增、电泳等步骤，较试纸条检测费时，而试纸条检测只需几分钟。因此，在临床应用时，需要结合2种方法才能又快又准确地做出诊断[8-14]。

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Development of RT-PCR to Detect Porcine Epidemic Diarrhea

XU Yindi,LU Zhiyuan,WANG Zhifang,LI Haili,ZHANG Qingxian,ZHU Wenhao,JIAO Wenqiang,LANG Limin,WANG Keling

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Research,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

In order to develop a rapid and specific test method for porcine epidemic diarrhea,reduing the losses to the pig industry caused by PEDV,a pair of primers were designed accroding to PEDVSgene sequence.Amplification conditions were optimized,RT-PCR method to detect PEDV was established.The method could specifically detect the RNA of PEDV.The method was used to test 256 samples of 38 Henan farms in 2016.The results showed that 157 samples were positive,30 farms were postivie,and the detection rate was higher than that of strip method.It indicated that the specificity of RT-PCR method to detect PEDV was good and could be used to diagnosis of suspected cases of infection and epidemiological investigation of PEDV.

PED; RT-PCR; detection

2017-03-22

河南省科技攻关计划项目(162102110042)；河南省农业科学院自主创新基金项目(2016ZC51)

徐引弟(1974-)，女，湖北浠水人，副研究员，博士，主要从事动物病原微生物研究。E-mail：445177674@qq.com

S855.3

： A

： 1004-3268(2017)09-0149-03