携尿激酶靶向微泡在超声介导下对兔股动脉溶栓的作用

2017-09-11阿丽米娜阿文

中国医学影像学杂志 2017年8期

关键词：微泡尿激酶栓塞

阿丽米娜·阿文·

关丽娜 GUAN Li'na

虎晓梅 HU Xiaomei

穆玉明 MU Yuming

携尿激酶靶向微泡在超声介导下对兔股动脉溶栓的作用

阿丽米娜·阿文A Limina·A Wen

关丽娜GUAN Li'na

虎晓梅HU Xiaomei

穆玉明MU Yuming

目的观察不同超声频率联合携尿激酶的靶向微泡造影剂对兔股动脉血栓的溶解作用，探讨影响溶栓作用的主要因素，寻找微循环再栓塞的相关指标。材料与方法72只新西兰大白兔制作单侧股动脉血栓模型，按照完全随机分组方法分为12组，每组6只。根据超声频率（1.6、2.2、2.8 MHz）、超声照射时间（30、60 min）、尿激酶剂量（3、6 mg）3因素不同水平进行实验组合。靶向微泡携带尿激酶在低频超声辅助照射下溶栓，观察血管的溶通情况，并通过HE染色证实有无微循环再栓塞。抽取兔血检测6-酮-前列腺素Fla（6-keto-PGF1a）、血栓素B2（TXB2）、P/T比值（6-keto-PGF1a/TXB2）及P-选择素（SP）等指标。结果超声频率2.2 MHz、超声照射时间30 min、尿激酶剂量3 mg组血管全部溶通且无微栓塞发生；其余各组均有未溶通或合并微循环再栓塞发生的情况。溶栓后无微栓塞组的兔6-keto-PGF1a含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而其他指标差异无统计学意义（P＞0.05）。结论超声频率2.2 MHz、超声照射时间30 min、尿激酶低剂量3 mg的条件下溶栓可实现血管的完全溶通。超声频率、超声照射时间及尿激酶剂量一定时可有效溶解血栓，但在溶栓的过程中可能会发生微循环的再栓塞。6-keto-PGF1a含量的升高对降低微循环再栓塞具有一定作用。

血栓栓塞；股动脉；超声检查，多普勒，彩色；微循环；血栓溶解疗法；造影剂；尿纤溶酶原激活物；疾病模型，动物；兔

急性冠状动脉综合征行药物溶栓或经皮冠状动脉介入术（percutaneous transluminal coronary intervention，PCI）后出现的远端微循环再栓塞是一种严重的术后并发症[1-2]。微血管栓塞是一个复杂的多因素现象，是血管痉挛、血小板聚集和微血管血栓形成的过程[3-4]。远端微血管栓塞与恶性心律失常有关，可引起射血分数降低，并诱发充血性心力衰竭导致猝死。因此，对于微血管栓塞的有效治疗和预防不仅能改善急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的临床症状，还能对疾病的预后起到积极作用。本研究应用靶向微泡联合超声溶栓技术，拟在既往实验基础上将新型靶向微泡Targestar-SA以生物素化法与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸片段（Arg-Gly-Asp-Ser，RGDS）、尿激酶结合，并形成携尿激酶的靶向微泡，经静脉注射联合超声溶栓治疗。根据不同超声频率、照射时间及不同尿激酶剂量进行组合，了解股动脉血栓在体溶栓及微循环再栓塞的发生情况[5]。

1 材料与方法

1.1 实验动物模型制备 72只新西兰大白兔由新疆医科大学动物中心提供，体重1.8～2.8 kg，本实验经新疆医科大学实验动物伦理委员会同意（批件号：20140403003）。采用戊巴比妥钠（30～40 mg/kg）麻醉实验兔，建立静脉通道，仰卧位固定，腹股沟区脱毛、备皮，钝性分离组织，分离股动脉，结扎其相应的深支和浅支。在该段股动脉后壁放置大小为2.5 cm×2.5 cm 的橡胶薄膜以保护动脉周围组织。在橡胶薄膜与股动脉后壁放置大小约0.5 cm×0.5 cm浸有15%三氯化铁溶液滤纸片环绕包裹股动脉，接触面约为股动脉周径的3/4。待血流稳定后，将股动脉的远端用动脉夹夹闭，7～8 min后取出动脉夹，约20 min后取出滤纸片，用生理盐水冲洗局部组织。血栓模型制作成功标准[6]：①在30 min内形成完全闭塞性血栓；②脉冲多普勒血流仪（Transonic，TS420，美国）监测血流量，血流量＜0.05 ml/min；③二维和彩色多普勒超声显示闭塞性血栓；④经HE染色证实为以血小板为主的混合性血栓。以上标准如有1项不符合即为阴性结果。自制作模型开始观察，观察120 min后终止实验。

1.2 携RGDS的靶向微泡尿激酶制备 Targestar-SA（美国Targeson公司提供） 0.3 ml，生物素化的尿激酶（南京源端生物科技有限公司提供）3 ml，RGDS（南京源端生物科技有限公司提供）3 ml。用注射器抽取以上3种药物，将SA与尿激酶和RGDS混合，在室温下静置后轻微摇荡30 s，待出现白色乳状悬浮液后在常温下静置20 min。

1.3 实验设备及分组方法采用意大利百胜公司Mylab90型彩色多普勒超声诊断仪，LA 240探头，频率1～4 MHz。选用3×2×2析因实验设计，将不同超声频率（因素 A1：1.6 MHz、A2：2.2 MHz、A3：2.8 MHz）、不同超声照射时间（因素B1：30 min、B2：60 min）、不同尿激酶剂量（因素C1：3 mg、C2：6 mg）的3因素不同水平进行实验组合。根据溶栓参数对72只兔进行分组。各组溶栓参数组合见表1。

表1 析因设计下72只兔各组溶栓参数设定方案

1.4 溶栓过程待血栓形成后，经耳缘静脉缓慢注射携RGDS的靶向微泡尿激酶。同时将探头置于血栓处，选择爆破条件，待微泡到达血栓处（图1），爆破约10 min，待股动脉内观察不到造影剂即可停止爆破，并用探头照射血栓处30 min，观察2 h。采用脉冲多普勒血流仪持续监测血栓形成前和给予溶栓治疗10、20、30、60、90、120 min后血流量。以脉冲血流计血流量恢复正常基础血流定义为溶通，进一步通过二维和彩色多普勒超声加以确定。

1.5 血清学检测每组大白兔分别在造栓前和溶栓治疗后抽取静脉血3 ml，EDTA-消炎痛抗凝，4℃条件下3500 r/min离心15 min，离心半径14 cm。离心后吸取上清液，－20℃保存。采用酶联免疫吸附（ELISA）双抗体夹心法测定标本中兔6-keto-PGF1a、兔血栓素B2（TXB2）、6-keto-PGF1a/TXB2（P/T 比值）、兔可溶性P-选择素（SP）水平。

1.6 病理检查实验结束后即刻结扎远、近端血管，取出血管后，给予过量麻醉药处死动物，切开兔后肢小腿背侧皮肤，钝性分离筋膜组织，取腓肠肌组织2.0 cm×1.5 cm，厚度为0.2 cm，标本用4%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋切片，HE染色，观察组织末端血管内有无微血栓存在。

1.7 统计学方法采用SPSS 23.0软件，不同水平组合下血清学的差值用析因设计的方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声检查结果经过不同超声频率联合携尿激酶的靶向微泡造影剂溶栓治疗，超声照射血栓处30 min或60 min后，根据彩色多普勒血流显像（CDFI）血流频谱特点观察血管的溶通情况。溶通组管腔内可见CDFI血流信号；未通组CDFI未见血流信号，管腔未被溶通。见图1。

图1 靶向微泡、尿激酶溶栓后血管再通的超声图像。溶通组股动脉血栓形成处经过溶栓后，管腔内有血流通过，血流信号表示血管被溶通（箭，A）；股动脉血栓形成处经过溶栓后，管腔内无血流通过，血流信号表示血管未被溶通（箭，B）

2.2 病理结果 72只实验兔中，11只出现微循环再栓塞，电镜下可见组织存在较明显的淤血和出血，白细胞聚集，组织呈蜡样变性，提示骨骼肌坏死，微血管中血栓由血小板纤维素和（或）红细胞组成，HE 染色呈粉红色证明微血栓形成。见图2。

图2 病理镜下溶栓后腓肠肌组织血管染色显示由纤维素及血小板组成的粉红色血栓，略透明（箭，HE，×400）

2.3 不同条件溶栓结果实验中仅A2B1C1组的6只实验兔血栓均被溶通且无微栓塞发生。其他各组溶栓后，股动脉血栓均有未溶通或出现微循环再栓塞情况。见表2。

2.4 溶栓后6-keto-PGF1a、TXB2、P/T比值及SP变化溶栓后，无微栓塞组兔血浆6-keto-PGF1a明显升高，与有微栓塞组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而两组TXB2、P/T比值以及SP差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 3。

2.5 不同水平组合下血清学的差值比较根据析因设计的方差分析，通过股动脉溶栓后血清学指标与不同时间点血清学指标的差值比较，得出最佳溶栓组合。A2B1C1组各值的差值变化最小，超声频率、超声照射时间和尿激酶剂量单个因素对溶栓效果的影响差异无统计学意义（P＞0.05）；但当超声频率、超声照射时间、尿激酶剂量3个作用相互交联溶栓时，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 4、5。

表2 不同条件下溶栓后血管溶通情况及发生微栓塞情况（只）

表3 溶栓后6-keto-PGF1a、TXB2、P/T 比值及SP的变化（±s）

分组动物数（只） 6-keto-PGF1a（ng/L） TXB2（ng/L） P/T比值 SP（ng/ml）有微栓塞组 11 152.71±5.20 126.00±15.38 1.24±0.15 160.47±11.31无微栓塞组 61 194.15±24.56 132.12±7.72 1.49±0.23 157.21±7.79t值 10.64 1.73 0.32 0.20P值＜0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

表4 溶栓与造栓前、溶栓与血栓形成时6-keto-PGF1a、TXB2、P/T 比值及SP的差值（±s）

注：SP1、SP2、TXB2-1、TXB2-2、P-GF1、P-GF2、P/T-1、P/T-2中的1代表溶栓后2 h造栓前，2代表溶栓后2 h造栓形成后

超声频率超声照射时间尿激酶 SP1 SP2 TXB2-1 TXB2-2 1.6 MHz 30 min 3 mg －0.03±9.24 －59.58±21.34 11.73±33.24 －104.79±24.14 6 mg －8.43±25.48 －103.81±20.78 10.26±25.64 －102.22±21.94 60 min 3 mg －15.99±37.61 －95.86±33.23 7.51±28.17 －100.40±20.00 6 mg －11.18±39.33 －62.21±35.59 14.68±26.84 －82.23±28.83 2.2 MHz 30 min 3 mg －24.21±32.22 －108.52±46.60 －18.86±26.27 －124.09±27.62 6 mg 12.57±45.94 －97.10±60.14 3.80±24.94 －98.12±16.29 60 min 3 mg 7.98±31.74 －60.00±32.23 4.42±37.19 －99.13±25.68 6 mg －3.26±28.45 －77.15±34.12 21.30±15.65 －91.14±15.73 2.8 MHz 30 min 3 mg －7.63±27.67 －66.45±24.00 17.43±4.84 －92.21±17.10 6 mg －9.94±12.66 －106.78±27.85 28.79±19.66 －81.11±28.26 60 min 3 mg －4.59±50.77 －98.98±24.96 5.08±27.04 －110.21±29.81 6 mg －0.53±69.85 －82.4±65.87 12.88±14.41 －101.42±27.23超声频率超声照射时间尿激酶 P-GF1 P-GF2 P/T-1 P/T-2 1.6 MHz 30 min 3 mg －6.79±31.62 －69.13±30.23 －0.21±0.48 0.25±0.20 6 mg －25.65±24.33 －78.21±24.79 －0.31±0.35 0.17±0.13 60 min 3 mg －12.01±35.01 －83.04±16.10 －0.18±0.28 0.17±0.18 6 mg 39.85±64.89 － 39.30±56.38 0.09±0.43 0.41±0.28 2.2 MHz 30 min 3 mg －12.76±17.47 －107.85±18.04 0.08±0.37 0.32±0.27 6 mg 38.18±50.91 － 52.19±46.86 0.27±0.53 0.50±0.47 60 min 3 mg 64.62±59.93 － 26.70±26.90 0.50±0.55 0.69±0.45 6 mg 1.81±35.50 －65.63±61.56 －0.25±0.24 0.28±0.49 2.8 MHz 30 min 3 mg 37.73±42.98 － 43.79±45.69 0.06±0.30 0.46±0.33 6 mg 14.13±57.53 －85.41±43.87 －0.16±0.39 0.04±0.24 60 min 3 mg 17.91±26.06 － 67.95±23.74 0.06±0.26 0.43±0.13 6 mg 1.88±46.54 －85.15±32.11 －0.12±0.35 0.11±0.20

3 讨论

目前超声溶栓的基本方法包括通过导管外部传感器超声溶栓、经皮超声波不添加药物或微泡和超声结合溶栓药物和（或）结合微泡共同溶栓。低频超声波与全身系统性（静脉）药结合可增加超声波溶栓的疗效[7]。然而近来研究发现，无论何种溶栓方式，溶栓后均有致血栓物质的再释放，斑块破裂后脂质碎片、基质成分及内皮细胞、炎症细胞脱落、血小板及白细胞黏附聚集等造成微循环再栓塞[8]。因此，使血栓完全溶解并防止溶栓后微血栓形成具有重要的临床意义。

既往实验应用诊断超声联合靶向微泡携带尿激酶完全溶解股动脉内血栓；但在实现血栓的有效溶解后，其末端的分支小血管伴随微循环的再栓塞[9]。本研究在前期实验研究的基础上，通过调整超声频率、超声照射时间和溶栓药物剂量这3大因素，使靶向血管内的血栓有效溶解，同时避免微循环栓塞。结果提示在12个不同溶栓组中，A2B1C1组，即超声频率2.2 MHz、超声照射时间30 min、尿激酶3 mg的溶栓效果最佳。通过多普勒血流仪监测溶栓过程时发现，该组所有动物治疗后全部实现了血管的溶通，经HE染色证实血栓纤维网架被破坏，证实血栓完全溶解且远端未见直径＜150 μm的栓子游离。本研究发现与高频超声比较，低强度超声功率可获得最佳的溶栓效果，而高强度超声不仅未能观察到有增强溶栓的效果，反而发现其可激活血小板[10]。超声照射时间方面，不断增加超声照射时间会对机体造成伤害，且溶栓效果也并未由于照射时间的增加而有所提升[11]。使用低剂量尿激酶是由于微泡具有靶向性，实现了靶向血栓的有效溶解。

表5 交互作用下溶栓与造栓前、溶栓与血栓形成时6-keto-PGF1a、TXB2、P/T 比值及SP的差值

正常情况下前列腺环素（prostacyclin，PGI2）是血管内皮细胞产生的前列腺素物质，也有抑制血小板聚集的作用。TXB2可刺激PGI2的合成。P/T比值的变化可反映血管舒缩状态和血小板聚集能力，两者平衡可维持正常的组织灌注。一旦平衡失调即可能导致血小板黏附、聚集，微血管痉挛，微血栓形成，组织灌注不良等一系列病理改变[12]。SP是常用的血小板活化指标，可反映血小板的活化程度，且敏感度、特异度均较高，可作为检测早期动脉血栓的靶标。本研究结果发现，溶栓后所有无微栓塞组的6-keto-PGF1a含量均明显高于有微栓塞组，故认为6-keto-PGF1a是溶栓后发生微栓塞的影响因素。

总之，本研究显示A2B1C1组所有动物均实现了血栓的溶通，并无远端微循环再栓塞发生。由此推断，超声频率2.2 MHz、照射时间30 min、尿激酶低剂量3 mg的条件组合可获得最佳的溶栓后血管微栓塞预防效果；且6-keto-PGF1a可作为界定溶栓后微循环是否发生微栓塞的重要指标。

[1] Brown AT, Flores R, Hamilton E, et al. Microbubbles improve sonothrombolysis in vitro and decrease hemorrhage in vivo in a rabbit stroke model. Invest Radiol, 2011, 46(3): 202-207.

[2] Jolly SS, Cairns JA, Yusuf S, et al. Randomized trial of primary PCI with or without routine manual thrombectomy. N Engl J Med, 2015, 372(15): 1389-1398.

[3] Go AS, Mozaffarian D, Roger VL, et al. Executive summary:heart disease and stroke statistics--2013 update: a report from the american heart association. Circulation, 2013, 127(1): 143-152.

[4] Liang NL, Avgerinos ED, Marone LK, et al. Equivalent outcomes between ultrasound-assisted thrombolysis and standard catheter-directed thrombolysis for the treatment of acute pulmonary embolism. J Vasc Surg Venous Lymphat Disord, 2015, 3(1): 120-121.

[5] 郭朝锋, 穆玉明, 关丽娜, 等. 超声在兔股动脉血栓模型评价中的价值. 中华超声影像学杂志, 2010, 19(10): 901-904.

[6] 关丽娜, 穆玉明, 王春梅, 等. 影响动脉血栓形成因素的超声研究. 中国超声医学杂志, 2011, 27(10): 873-877.

[7] Mccabe JM, Huang PH, Riedl L, et al. Usefulness and safety of ultrasound-assisted catheter-directed thrombolysis for submassive pulmonary emboli. Am J Cardiol, 2015, 115(6):821-824.

[8] Goto S, Hasebe T, Takagi S. Platelets: small in size but essential in the regulation of vascular homeostasis-translation from basic science to clinical medicine. Circ J, 2015, 79(9):1871-1881.

[9] 关丽娜, 穆玉明, 王春梅, 等. 尿激酶RGDS微泡在体溶栓的血流频谱特点与可能机制的实验研究. 中华超声影像学杂志, 2010, 19(11): 997-1000.

[10] Somnuk K, Smithmaitrie P, Prateepchaikul G. Feasibility of using ultrasound-assisted biodiesel production from degummed-deacidi fi ed mixed crude palm oil using small-scale circulation. Kasetsart Journal Natural Science, 2012, 46(4):662-669.

[11] Stride E. Physical principles of microbubbles for ultrasound imaging and therapy. Cerebrovasc Dis, 2009, 27(Suppl 2):1-13.

[12] Ma N, Liu XW, Yang YJ, et al. Evaluation on antithrombotic effect of aspirin eugenol ester from the view of platelet aggregation, hemorheology, TXB2/6-keto-PGF(1 alpha) and blood biochemistry in rat model. BMC Vet Res, 2016, 12(1):1-10.

（本文编辑闻浩）

Thrombolytic Effect of Urokinase-containing Targeted Microbubble on Rabbit Femoral Artery Under Ultrasonic Guidance

PurposeTo observe the thrombolytic effect of different ultrasonic frequencies combined with urokinase-containing targeted microbubble contrast agent on rabbit femoral artery, to explore the main in fl uencing factors, and to determine the potential indicators related to recurrent embolism in the microcirculation.Materials and MethodsUnilateral femoral arterial thrombosis models were established in the selected 72 New Zealand white rabbits, which were randomly divided into 12 groups, 6 rabbits in each group. This study was performed on an experimental combination of three factors and different levels,including different ultrasonic frequencies (1.6, 2.2, 2.8 MHz), different ultrasonic irradiation time (30 and 60 min), and different urokinase dose (3 and 6 mg). Thrombolysis with urokinase-containing targeted microbubble was performed under low frequency ultrasonic assisted irradiation, the recanalization status of blood vessels was observed, and recurrent embolism in the microcirculation was con fi rmed by HE staining. Furthermore,rabbit blood samples were collected, with indicators, including 6-keto-prostaglandin F1a(6-keto-PGF1a), Thromboxane B2(TXB2), P/T ratio (6-keto-PGF1a/TXB2) and P-selectin(SP) being detected.ResultsAll the vessels were recanalized. There was no occurrence of recurrent embolism in the group with ultrasonic frequency of 2.2 MHz, radiation time of 30 min, and urokinase dose of 3 mg. Rabbits' blood vessels were observed to be not completely recanalized in other groups, accompanied with different degree of recurrent embolism in the microcirculation. 6-keto-PGF1a content of the rabbits in the group without recurrent embolism obviously increased after thrombolysis, and the difference was statistically significant (P＜0.05). While, there was no statistical difference in other indicators (P＞0.05).ConclusionThe thrombolysis with ultrasound frequency of 2.2 MHz,irradiation time of 30 min, and urokinase dose of 3 mg could achieve complete recanalization of blood vessels. Under the certain conditions of ultrasonic frequency,irradiation time and urokinase dosage, thrombus can be effectively dissolved. However,there may be risk of recurrent embolism in the microcirculation during thrombolysis process. The increase of 6-keto-PGF1a content has a certain effect on reducing the formation of recurrent embolism in the microcirculation.

Thromboembolism; Femoral artery; Ultrasonography, Doppler, color;Microcirculation; Thrombolytic therapy; Contrast media; Urinary plasminogen activator;Disease models, animal; Rabbits

新疆医科大学第一附属医院心脏超声诊断科新疆乌鲁木齐 830054

穆玉明

Department of Echocardiography, the First Af fi liated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China

Address Correspondence to:MU Yuming

E-mail: mym1234@126.com

国家自然科学基金（81301230）。

R445.1；R543

2017-02-07

修回日期：2017-04-05

中国医学影像学杂志

2017年第25卷第8期：561-565，571

Chinese Journal of Medical Imaging