锰浓度对不同结肠癌细胞株锰增强磁共振成像效果的影响

文 亮

石西南2 SHI Xi'nan

何利平3 HE Liping

鲁 毅1 LU Yi

韩 丹1 HAN Dan

锰浓度对不同结肠癌细胞株锰增强磁共振成像效果的影响

文 亮1WEN Liang

石西南2SHI Xi'nan

何利平3HE Liping

鲁 毅1LU Yi

韩 丹1HAN Dan

目的锰浓度是影响肿瘤锰增强磁共振成像（MEMRI）效果的最基本因素，本文研究其对不同结肠癌细胞株MEMRI效果的影响。材料与方法在0、0.05、0.10、0.20 mmol/L锰浓度下分别对人结肠癌细胞株SW620（高转移潜能）、SW480（低转移潜能）与正常细胞株CCD841 CoN进行体外MEMRI检测。T1 map计算细胞株在不同锰浓度下的平均T1缩短值。结果锰浓度为0.10、0.20 mmol/L时，3种细胞株平均T1缩短值大小依次为SW620＞SW480＞CCD841 CoN，差异有统计学意义（P＜0.01）。正常细胞株在不同锰浓度（0.05、0.10、0.20 mmol/L）下平均T1缩短值差异无统计学意义（P＞0.05）；两种瘤细胞平均T1缩短值随锰浓度升高而升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。在较高锰浓度（0.10、0.20 mmol/L）条件下，SW620较SW480摄锰更多。结论结肠癌细胞体外摄锰程度随锰浓度升高而增加，MEMRI可区分具有不同转移潜能的结肠癌细胞株。

结直肠肿瘤；磁共振成像；图像增强；肿瘤细胞，培养的；锰

结肠癌是常见且死亡率较高的恶性肿瘤之一[1]。MRI已越来越多地应用于结直肠癌的诊断与分期[2-4]，但常规MRI主要基于形态学改变诊断肿瘤，仍存在诸多局限。锰增强磁共振成像（manganese-enhanced magnetic resonance imaging，MEMRI）是采用细胞内特异性造影剂实现细胞成像的技术，其在检出恶性肿瘤、发现早期小瘤灶以及判断肿瘤的恶性程度等方面具有一定的应用价值[5-12]，但尚未见结肠癌相关的研究报道。为深入分析肿瘤MEMRI的影像表现、探讨其在结肠癌诊断中的应用价值，本研究拟以不同结肠癌细胞株为研究对象，探讨锰剂浓度对结肠癌细胞MEMRI增强效果的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞活性实验 采用台盼蓝拒染法检测对数生长期细胞在0.20 mmol/L锰浓度培养基中培养60 min后的活性。光镜下观察细胞染色情况，根据公式（1）计算细胞存活率。

1.2 细胞株及细胞培养 人结肠癌细胞株SW620、SW480购自ATCC；正常人结肠黏膜上皮细胞株CCD841 CoN购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。SW620、SW480细胞株分别来源于同一患者的淋巴结转移和结肠癌原发灶，具有明显不同的恶性潜能，SW620转移潜能较SW480高[13]。培养基为RPMI1640，添加15%胎牛血清（Invitrogen，Rockville，MD），在 37℃、5% CO2、95% 空气湿度条件下培养、传代。

1.3 细胞MEMRI 用胰酶消化对数生长期的贴壁细胞，吹匀后将细胞混悬液平均分装于4个15 ml的Corning离心管内。取其中3管，分别加入MnCl2·4H2O（分子量197.91 g/mol，Sigma-Aldrich）溶液配成锰浓度分别为0.05、0.10、0.20 mmol/L的混悬液，吹匀后于37℃、5% CO2环境中静置60 min，一方面使细胞摄取与排出锰离子达到动态平衡，另一方面避免过于久置影响细胞活性。将试管于1000 g条件下离心10 min、吸去部分上清后吹匀，将细胞混悬液移入1.5 ml Corning离心管。将试管置于1000 g条件下离心10 min、吸去上清后分别加入新鲜培养基吹匀清洗1 min，再次同条件下离心。重复上述过程3次后，在离心管底部得到厚度近10 mm的细胞团。未加锰剂的细胞用相同方法制备作为对照。

MR扫描仪为飞利浦3.0T临床用机型，采用8通道头部线圈。机架孔径内温度约为25℃，行T1WI及T1 map扫描，均扫描离心管横断面。T1WI采用自旋回波序列，TR 597.22 ms，TE 12.40 ms，视野（FOV） 60 mm，层厚 1 mm，间隔 1 mm，采集次数29，矩阵 144×144。T1 map采用反转恢复序列，TR 3000 ms，TE 18.5 ms，TI 50、100、250、500、750、1000、1250、1500、2000、2500 ms。FOV 60 mm，层厚 1 mm，间隔 1 mm，采集次数 28，矩阵 144×144。T1 map数据导入MatLab（7.0版本）中的软件进行计算，于试管底部细胞团层面手动勾画圆形感兴趣区，感兴趣区面积约为7 mm×7 mm。将不加锰剂所测的T1均值减去加入锰剂后所测的T1均值得到平均T1缩短值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件，采用单因素方差分析比较细胞活力。采用两因素方差分析比较各细胞株平均T1缩短值的差异，两个因素分别是细胞株与锰剂浓度，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 锰浓度的确定 正常人结肠黏膜上皮细胞CCD841 CoN、低转移人结肠癌细胞SW480、高转移人结肠癌细胞SW620在0.20 mmol/L锰浓度下培养60 min，3种细胞存活率分别为（93±2）%、（96±3）%、（98±1）%，差异无统计学意义（F=0.413，P＞0.05），由此确定细胞MEMRI的锰剂浓度为0.05、0.10、0.20 mmol/L。

2.2 不同锰剂浓度下3种结肠细胞的MEMRI效果T1WI直观显示细胞MRI增强情况，见图1。正常人结肠黏膜上皮细胞CCD841 CoN在锰剂存在条件下未见增强。两种人结肠癌细胞SW480和SW620随锰剂浓度增高而增强。锰剂浓度为0.10、0.20 mmol/L时，增强程度SW620＞SW480＞CCD841 CoN；锰剂浓度为0.05 mmol/L时，3种细胞增强程度差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 不同浓度锰剂处理后3种细胞的MRI T1WI

T1 map计算测值显示3种细胞株均不同程度地摄取锰离子。对正常细胞株而言，3个锰浓度组间细胞摄锰程度差异无统计学意义（P＞0.05）；两种瘤细胞摄锰程度随锰剂浓度增高而增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。锰浓度为0.05 mmol/L条件下，3种细胞株平均T1缩短值差异无统计学意义（P＞0.05）；锰浓度分别为0.10、0.20 mmol/L条件下，3种细胞株平均T1缩短值差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。T1 map和T1WI结果一致。

3 讨论

锰离子有5个不成对的电子，具有强顺磁性，能缩短周围氢质子的纵向弛豫时间增加对比。常规钆剂Gd-DTPA的增强效果主要依赖肿瘤血供程度，锰剂更多地依赖细胞对锰离子的摄取。近年研究发现MEMRI应用于肿瘤诊断，包括检出早期较小瘤灶、反映肿瘤的恶性度以及瘤细胞的增殖率等。研究肿瘤锰增强效果的影响因素有助于理解成像表现，为进一步拓展该技术的应用提供实验依据。本实验以人结肠正常与癌细胞株为对象，进行体外MEMRI检测，观察不同锰浓度条件下不同细胞株的锰强化表现。

表1 不同浓度锰剂处理后3种细胞株平均T1缩短值比较（±s，ms）

表1 不同浓度锰剂处理后3种细胞株平均T1缩短值比较（±s，ms）

注：1.为相同浓度锰剂处理时3种细胞株间平均T1值缩短比较所得F值和P值；2.为相同细胞株不同锰浓度处理时平均T1值缩短比较所得F值和P值

锰浓度（mmol/L） CCD841 CoN SW480 SW620 F值1 P值10.05 52.72±2.06 52.78±1.96 50.89±0.25 1.264 ＞0.05 0.10 53.53±2.86 127.77±2.83 289.33±0.57 7923.965 ＜0.001 0.20 54.62±3.23 228.15±3.00 468.28±1.46 18 053.632 ＜0.001F值2 0.358 3345.148 156 491.928 — —P值2 ＞0.05 ＜0.001 ＜0.001 — —

细胞生存需要摄取锰离子维持功能，不论正常细胞还是瘤细胞均摄取锰离子。本研究结果表明，当锰浓度逐渐增加时，正常细胞摄锰变化不明显，瘤细胞摄锰程度则逐渐增加，与No fi ele等[10]报道的人乳腺癌细胞株体外摄锰的MEMRI实验结果类似。MEMRI检测肿瘤时可以通过增加锰剂浓度获得肿瘤与正常组织之间尽可能大的信号差别，从而提高病灶检出率。锰浓度越高，T1值缩短越明显，但同时其细胞毒性也更大。将锰浓度控制在细胞活性不受明显影响、同时兼顾增强效果的水平是实验成功的关键。细胞需要微量锰离子来维持生理功能，如线粒体内的锰超氧化物歧化酶需要结合锰离子而激活来清除代谢产物中的氧自由基。正常细胞具有健全的自我调节、保护机制，能够控制所需锰离子的摄入量，在外界锰浓度提高时仍能维持正常的摄锰水平。瘤细胞功能发生异常，缺乏有效的调节机制，导致外界锰离子无限制内流入瘤细胞，故其摄锰量随外界锰浓度提高而持续增加。

本实验采用的两种瘤细胞株为同一患者来源的结肠癌细胞株，两者的性状差异主要表现为具有不同的转移潜能。当锰浓度从0.05 mmol/L提高到0.10、0.20 mmol/L时，高转移结肠癌细胞SW620细胞株表现出高于低转移结肠癌细胞SW480的摄锰能力，提示瘤细胞摄锰除受外界锰浓度影响外，还受细胞株本身生物学性质的影响。No fi ele等[10]也发现相同条件下，侵袭性高的人乳腺癌细胞株体外摄锰能力明显高于其他恶性程度低的细胞株。既往研究认为瘤细胞摄锰能力与细胞增殖周期有关[8,14]。Braun等[8]发现增殖率高的瘤细胞摄锰较增殖率低者更明显。据此推测，可以依据瘤细胞的MEMRI强化差异间接判断瘤细胞的恶性程度，其他种类的瘤细胞株及在体肿瘤MEMRI是否表现相同的现象仍需进一步实验证实。

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（本文编辑 饶亚岚）

Impact of Manganese Concentration on Manganese-enhanced Magnetic Resonance Imaging in Different Colon Cancer Cell Lines

PurposeManganese (Mn) concentration is one of the basic factors that have impact on manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI) enhancement of neoplasm. This study aims to elucidate the impact of Mn concentration on enhancement of MEMRI in different colon cancer cells.Materials and MethodsThe human colon cancer cell SW620 with high metastatic potential, SW480 with low metastatic potential and the normal cell CCD841 CoN were performed MEMRI under different Mn concentrations (0,0.05, 0.10 and 0.20 mmol/L)in vitro. The average values of T1 shortening were calculated by T1 map scan in different cells under different Mn concentrations.ResultsWhen the concentration of Mn was 0.10 and 0.20 mmol/L, the average value of T1 shortening of the three cell lines was SW620＞SW480＞CCD841 CoN (P＜0.01). There was no significant difference in the average T1 value of the normal cell lines under different Mn concentrations (0.05, 0.10, 0.20 mmol/L) (P＞0.05). The average T1 value of two tumor cells increased with the increase of Mn concentration. Under the condition of high Mn concentration (0.10 and 0.20 mmol/L), SW620 took in more Mn than SW480.ConclusionColon cancer cells increase Mn uptake with increasing of Mn concentration. MEMRI can distinguish colon cancer cells with different metastatic potential.

Colorectal neoplasms; Magnetic resonance imaging; Image enhancement;Tumor cells, cultured; Manganese

1. 昆明医科大学第一附属医院影像科 云南昆明 650030

2. 云南中医学院生理病理学教研室 云南昆明 650030

3. 昆明医科大学公共卫生学院 昆明呈贡650000

韩 丹

Department of Radiology, the First Af fi liated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650030, China

Address Correspondence to:HAN Dan

E-mail: kmhandan@sina.com

R445.2；R730.4

2017-03-25

2017-06-08

中国医学影像学杂志

2017年 第25卷 第8期：572-574，578

Chinese Journal of Medical Imaging 2017 Volume 25 (8): 572-574, 578

10.3969/j.issn.1005-5185.2017.08.003