球形孢子丝菌与孢子丝菌属其它模式菌株的形态特征差异

赵明丹，周 汛

（重庆市中医院皮肤美容科，重庆 400012）

球形孢子丝菌与孢子丝菌属其它模式菌株的形态特征差异

赵明丹，周 汛*

（重庆市中医院皮肤美容科，重庆 400012）

目的 比较菌丝相下球形孢子丝菌与孢子丝菌属其它菌种的形态特征差异，探讨鉴定球形孢子丝菌的形态学。方法 分别接种15株从临床分离的中国球形孢子丝菌和6株其它孢子丝菌属模式菌株，用光学显微镜从菌落、菌丝、孢子形态及生长速度进行比较。结果 球形孢子丝菌镜下形态为球形或倒梨型，申克孢子丝菌模式菌株镜下呈长杆状；临床分离菌株生长缓慢，环境菌株生长较快。结论 球形孢子丝菌与孢子丝菌属其他菌种在菌落颜色、生长速度、镜下菌丝、孢子均存在差异，为临床快速有效鉴别孢子丝菌菌种奠定基础。

孢子丝菌；菌落特点；形态学

孢子丝菌病是由申克孢子丝菌引起的一种急性或慢性皮肤及皮下组织的真菌感染性疾病，可由呼吸道、被污染的土壤及植物、患病动物咬伤等传染致病，临床常表现为皮肤化脓、溃烂及渗出，咳嗽、发热等，临床分型可分为皮肤型和系统型，后者可累及骨、肺、眼等多个器官[1]。临床上常需进行全身性治疗，除口服抗真菌药物外，局部外用光动力可缩短口服药物疗程，减少不良事件发生。我国东北地区为此病好发区域，长久以来我国各地区孢子丝菌病的病原菌一直被认为是申克孢子丝菌，近来研究表明我国孢子丝菌病的致病菌是球形孢子丝菌[2-3]。本实验通过比较球形孢子丝菌与其它孢子丝菌的生物学形态差异，为鉴定球形孢子丝菌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 15株从临床分离菌株，6株购买自荷兰CBS真菌多样性研究中心孢子丝菌其它模式菌株：环境分离菌种：墨西哥孢子丝菌模式菌株（CBS 120341），Sporothrix humicola（CBS 118129），Sporothrix lignivora（CBS 119148）；球形孢子丝菌的模式菌株（CBS 120340），申克孢子丝菌模式菌株（CBS 359.36），申克孢子丝菌卢艾里变种模式菌株（CBS 937.37）。

1.1.2 培养基 2%土豆葡萄糖琼脂（PDA）培养基。

1.2 方 法

1.2.1 菌株复苏 将实验菌株接种于PDA试管中，每隔7d传代1次，连续传代2～3次，观察镜下菌落形态，保证菌株的纯度和生长活力。

1.2.2 菌株培养 纯化后菌株接种在PDA培养基平板中央，接种物直径2mm，25℃倒置培养28d，每隔7d观察菌落长势并测量菌落的生长速度。每组菌落设置3个培养皿，重复测试3次。

1.2.3 玻片小培养 PDA琼脂块置于无菌载玻片上，厚度以2～3mm为宜；将菌株接种在琼脂块上，置于25℃下培养7天，揭下盖玻片覆盖在新载玻片上，光镜下(100×)进行形态学观察。

2 结 果

2.1 菌落形态

所有的孢子丝菌均呈现较好的生长菌落生长平整，圆形可见白色绒毛状菌丝，培养21d时球形孢子丝菌菌落出现皱褶。CBS 359.36和CBS 937.37菌丝为白色，CBS 120341菌丝呈棕色，CBS 118129菌丝为白色，21d时菌落周围可见一圈白色透明状绒毛。CBS 119148菌落环状，背面为黑褐色，菌丝呈墨绿色，随菌落生长颜色逐渐加深，14d前菌落边缘可见白色菌丝，21d后变为墨绿色菌丝，见图1。

2.2 生长速度

我国15株临床分离菌株及CBS 120340及CBS 359.36，CBS 937.37生长较慢；CBS 120341、CBS 118129、CBS 119148均为环境分离菌株，生长速度较快，7d、14d、21d、28d时的生长速度均超过临床分离株，CBS 119148的生长速度最快，21天菌落平均直径达76mm，见表1、图2。

图1 不同菌株培养期间菌落形态在25℃PDA培养基上7天，14，21天和28天菌落形态，从上至下分别为：(a)临床分离菌株来自北京地区，(b)临床分离菌株来自吉林地区，(c)临床分离菌株来自重庆地区， (d)S.globosa(CBS 120340)，(e)S.schenckii(CBS 359.36),(f)S.schenckii var.luriei(CBS 937.72)., (g) S.mexicana(CBS 120341),(h)S.humicola(CBS 118129),(i)S.lignivora(CBS 119148)。

表1 不同菌株培养期间菌落平均直径（mm）

2.3 镜下形态

球形孢子丝菌光镜下在顶端及菌丝两侧均可见呈圆形或倒梨型排列的分生孢子，菌丝两侧附着较少的呈袖套样分生孢子。CBS 359.36显微镜下可见菌丝顶端呈长杆状排列的分生孢子，在菌丝两侧未见孢子附着。CBS 937.37光镜下在顶端呈杆状样状排列的小分生孢子。环境菌株CBS 120341、CBS 119148和CBS 118129光镜下在顶端可见呈排列的长椭圆形的分生孢子。

3 讨 论

本次研究发现，来自环境菌株的孢子丝菌比临床分离的孢子丝菌生长速度快，7d，14d，21d，28d时的生长速度均超过临床分离株，从环境分离而来的模式菌株CBS 119148的生长速度最快，21天菌落平均直径达76mm，菌落颜色呈墨绿色。而来自临床分离菌株生长速度较慢，我国临床型孢子丝菌分离菌株21天菌落平均直径为41mm，菌落颜色为棕色或白色，环境菌株21天菌落直径均＞50mm，而临床菌株21天时菌落直径均＜50mm[4]。孢子丝菌菌落颜色越深说明产生的孢子越多，致病性越强[5,6]。本实验菌落颜色较深的是我国临床分离株和Sporothrix lignivora[7,8]，故本次研究考虑以上两种菌株毒力最强；在我国三个地区分离的孢子丝菌中，来自重庆和北京地区的孢子丝菌菌落颜色棕白色，而吉林地区的孢子丝菌菌落颜色呈黑色，表面皱褶，说明我国不同地区的球形孢子丝菌孢子形态存在差异，且吉林地区孢子丝菌致病力更强，与之前研究显示我国东北地区为孢子丝菌好发区域情况相吻合，提示临床可根据疾病发生区域推测菌种类型，从而减少检查人员工作量，提高诊断效率。

我们发现球形孢子丝菌镜下顶端孢子以圆形、倒卵圆形或梨形固着分生孢形为特点，而申克孢子丝菌镜下顶端孢子以长杆状为特点，这也许是在镜下区别孢子丝菌两个种的要点。本次研究证明，在临床上可以通过小培养观察顶端分生孢子形态，测量菌落直径来鉴别孢子丝菌种。

综上所述，孢子丝菌的多样性导致了孢子丝菌属的不同特征，本实验通过菌株的生物学特性对孢子丝菌属进行区别，为孢子丝菌提供了临床研究基础，从而快速有效地鉴定菌种，从而指导临床治疗方案及预后判断。

[1] 李聪慧,冉玉平,王鹏等.发生于双侧腰部的孢子丝菌病1例 [J].中国真菌学杂志,2012,07(1)∶31-32.

[2] 黄梦雅,刘婷婷,杨致邦等.16株中国东北地区临床孢子丝菌菌种分子生物分类学研究[J].中国人兽共患病学报,2014,30(9)∶904-908.

[3] 谭静文,刘伟,万喆等.来自中国北方部分地区33株孢子丝菌菌株的表型和基因型鉴定[J].菌物学报,2013,32(2)∶161-167.

[4] 刘婷婷.中国地区临床孢子丝菌的系统发育分析[D].重庆医科大学,2014.

[5] 毕云斐,齐琳,李福秋等.孢子丝菌病及影响申克孢子丝菌毒力因素的研究进展[J].中国老年学杂志,2015,(8)∶2301-2303.

[6] 贺羽,黄宜进,赵秘密等.中国临床球形孢子丝菌菌丝相药物敏感性分析[J].中国真菌学杂志,2016,11(4)∶209-212.

[7] 贺羽,黄梦雅,胡青碧等.中国南北方地区临床孢子丝菌菌种鉴定[J].中国真菌学杂志,2015,10(5)∶279-282.

[8] 刘婷婷. 中国地区临床孢子丝菌的系统发育分析[D]. 重庆医科大学, 2014.

The difference of morphological characteristics among Chinese clinical strains and the others of Sporothrix schenckii complex

ZHAO Ming-dan, ZHOU Xun
(Department of dermatology, Chongqing Hospital of traditional Chinese Medicine, Chongqing City, 400016, China)

Objective Comparison of morphological characteristics of spherical mycelial phase of Sporothrix schenckii and other strains of Sporothrix,to investigate the morphological identification method of spherical sporotrichosis. Methods 15 strains isolated from clinical isolates of Sporothrix China spherical bacteria and 6 strains of other Sporothrix strains were inoculated; The colony, hyphae, spore morphology and growth rate were compared by light microscopy. Results The spherical Sporothrix morphology under microscope for spherical or inverted pear, and Sporothrix schenckii strains under microscope were rod-shaped. The clinical isolates grew slowly and the environmental isolates grew rapidly. Conclusion There are differences in the color of colonies, the growth rate, the microscopic hyphae and the spores of other species, which lays the foundation for the rapid and effective identification of filamentous bacteria.

Sporothrix; Colonies Features; Morphological

图2 不同菌株培养期间菌落直径

图3 不同菌株培养期间镜下形态在25℃PDA培养基上7天镜下孢子形态（100X）A∶临床分离菌株来自北京地区，B∶临床分离菌株来自吉林地区，C∶临床分离菌株来自重庆地区，D∶S.globosa(CBS 120340)，E∶S.schenckii(CBS 359.36), F∶S.schenckii var.luriei(CBS 937.72).,G∶S.mexicana(CBS 120341), H∶S.humicola(CBS 118129), I∶S.lignivora(CBS 119148)。

国家自然科学基金（No. 31270062）

赵明丹（1985—），女，硕士，主治医师，研究方向：医学真菌学。

周汛（1970—），女，博士，教授、主任医师，研究方向：医学真菌学。

DOI∶ 10.19593/j.issn.2095-0721.2017.08.039