人类白细胞抗原-G1蛋白纯化及其免疫耐受机制初探

毕丽丽，孙玉洁，孔祥瑞，高钰，马锡慧，韩永，肖漓，石炳毅（解放军第三〇九医院全军器官移植研究所，北京市器官移植与免疫调节重点实验室，北京，100091）

器官移植的成败取决于供受者之间的组织相容性，其中人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）等位基因的匹配程度起关键作用［1］。HLA-G作为一种非经典的MHCⅠ类分子，通过其受体细胞内的免疫受体酪氨酸抑制性基序（immune receptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM）传递抑制性信号，抑制免疫细胞的活性，从而实现免疫耐受［2-3］。HLA-G初始转录本的选择性剪接可以产生7种亚型，包括4种膜结合型（HLA-G1-G4）和3种可溶型（HLA-G5-G7）［4］。HLA-G的主要受 体 有 3种：ILT2/LILRB1/CD85j、ILT4/LILRB2/CD85d和KIR2DL4/CD158d，主要表达于淋巴细胞、自然杀伤（natural kill， NK）细胞和树突状细胞（dendritic cells， DC）等免疫细胞［5］。

HLA-G在介导妊娠免疫、肿瘤免疫、移植免疫过程中，对细胞因子表达谱均具有重要的调控作用［6］。Xiao等［7］研究发现，在肾移植术后功能稳定组患者血浆中sHLA-G的表达水平显著高于急性排斥反应（acute reaction， AR）组。Th0细胞在不同细胞因子的诱导下可以分化为Th1、Th2和Th17等多种亚群，它们在介导免疫排斥反应和免疫耐受平衡中的关系密切而复杂［8］。

细胞因子在介导免疫耐受方面也发挥着重要作用［9］。CD4+Th细胞在不同的细胞因子诱导下可以分化为Th1、Th2、Th17等亚群，Th2细胞及其分泌的细胞因子白细胞介素（IL-4、IL-10）等与移植免疫耐受密切相关［4］。肾功能稳定组与AR组患者的比较结果显示，AR组IL-10含量升高［10］。研究肾移植术后HLA-G及其受体对Th2类细胞因子表达的调控机制，对肾移植术后诱导免疫耐受机制提供重要的理论依据和新靶点，为肾移植术后评判和治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料：健康供者外周血。大肠杆菌菌株BL21，pET28a质粒。

1.2 方法

1.2.1 构建原核表达载体：HLA-G基因（编码区序列由艾普希隆公司通过化学方法合成）序列全长1022 bp，编码区长1020 bp，共编码340个氨基酸。分别在基因序列的5’端和3’端引入限制性内切酶Ncol和Xhol的酶切位点识别序列。将目的基因HLA-G连接到pMD19-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态DH5α，进行扩增繁殖。用Ncol和Xhol对pMD19-T-HLA-G和pET28a载体进行双酶切后，将目的基因片段连接到载体DNA上。然后，用插入了HLA-G基因的重组质粒转化大肠杆菌感受态BL21。

1.2.2 蛋白诱导表达与纯化：挑取平板活化的单菌落，加入10 ml 含卡那霉素的LB液体培养基中，过夜摇菌；次日早晨按1%转接于50 ml 含卡那霉素的LB 液体培养基中，待其吸光度（A）值为0.5～0.7 时加入IPTG（0.5 mol/L）诱导；5 000×g离心5分钟，收集菌体，5 ml PBS平衡缓冲液进行悬浮破碎；10 000×g离心20分钟；沉淀用5 ml PBS重悬；最后将上清液和沉淀进行15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）。经镍柱纯化，获得HLA-G1蛋白。

1.2.3 蛋白免疫印迹试验（Western Blot）分析：纯化后蛋白先经SDS-PAGE，用半干法将分离的蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。转膜后封闭液室温封闭1小时，然后加入小鼠抗HLA-G抗体，4℃旋转震荡过夜。TBST洗涤3次，每次5分钟，之后加入辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HPR）标记的羊抗小鼠抗体，室温孵育1小时。TBST洗涤3次，每次5分钟，按照显色底物说明进行显色。

1.2.4 HLA-G1蛋白和外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC）共培养后检测B细胞分泌IL-10的表达：将健康供者的外周血用淋巴细胞分离液分离出PBMC，将纯化的HLA-G1蛋白（分4个浓度梯度：0、50、100、200 ng/ml）与人PBMC混匀后，置于细胞培养箱中孵育16小时，通过流式细胞仪检测B淋巴细胞内IL-10的水平。

2 结 果

2.1 原核表达载体的鉴定（图1）：用限制性内切酶Ncol和Xhol对重组质粒进行双酶切，根据电泳图，选择酶切正确的重组质粒进行测序，结果与GeneBank公布的序列一致。

图1 pET28a-HLA-G双酶切电泳图

2.2 HLA-G1蛋白的表达 （图2，图3）：纯化后的蛋白经SDS-PAGE鉴定其纯度，再经Western Blot技术鉴定蛋白。

2.3 HLA-G1对B细胞内IL-10表达的影响（图4）：将HLA-G1蛋白与人PBMC共培养16小时后，收集细胞，CD19 APC标记细胞膜，破膜后，IL-10 PE标记细胞内IL-10，通过流式细胞仪检测B淋巴细胞内IL-10的表达情况。结果发现，随着HLA-G1蛋白浓度的增加，B淋巴细胞内IL-10的表达水平明显升高。

图2 纯化后HLA-G1的蛋白（SDS-PAGE）

图3 纯化后的HLA-G1蛋白（Western Blot）

图4 HLA-G1 4种浓度与PBMC共培养后流式细胞仪检测

3 讨 论

母体因HLA-G而对胎儿产生特异性的免疫耐受，提示HLA-G分子可能在肾移植后的免疫耐受中起作用［11］。为研究HLA-G1的功能，本研究通过原核表达系统，诱导表达HLA-G1蛋白，经镍柱纯化得到HLA-G1蛋白，蛋白纯度高达95%以上，以便对其生物学功能进行进一步研究。

IL-10作为一种Th2类细胞因子，通过与受体IL-10R1和IL-10R2结合，诱导STAT3介导的信号转导系统，抑制不同靶基因，在诱导免疫耐受方面起重要作用。HLA-G可使Th2类细胞因子 （IL-10）分泌量上升，使免疫平衡向Th2偏移介导免疫耐受。同时，IL-10又能上调HLA-G的表达，这样HLA-G与IL-10之间可形成正反馈，造成明显的Th1/Th2漂移［12］。近年来研究发现，HLA-G诱导的tDC可以分泌高浓度的抑制性细胞因子IL-10，在DC的免疫调控中具有重要作用［13-14］。IL-10可以对Th细胞亚群进行双向调节：一方面IL-10可以抑制抗原递呈细胞（antigen presenting cell， APC）产生γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）和IL-12，抑制巨噬细胞的活性，从而抑制Th1细胞的分化，间接促进Th2细胞分化；另一方面，IL-10可以通过抑制B7-2分子的表达而间接抑制Th2细胞分化［15］。吕海燕等［13］研究发现，HLA-G 可以诱导产生tDC并上调HLA-G的表达水平，进一步释放IL-10等抑制性细胞因子，还可以诱导产生调节性T细胞，协同HLA-G诱导免疫耐受。

本研究中，与4种浓度梯度HLA-G1共同培养的B淋巴细胞，细胞因子IL-10的分泌量显著增加，并且随着HLA-G1浓度梯度的上升，IL-10的表达水平也随之升高。这与前人的研究结果是一致的［16］。

近年来的研究表明，在外周血及移植物中检测到HLA-G分子的器官移植患者中，发生AR的风险更低［17-18］，但研究多集中在HLA-G对T淋巴细胞的影响。本研究关注HLA-G1对B淋巴细胞的免疫调控作用，希望可以对肾移植术后的体液免疫调控研究提供新思路。同时，为了更深入的了解HLA-G1的免疫耐受机制，我们还需要对更大量样本进行进一步探究。