杜仲树皮产量和活性成分含量与生长指标的相关性分析

2017-09-09王伟文欢汪颀浩张大燕彭成高继海

山东农业科学 2017年8期

王伟+文欢+汪颀浩+张大燕+彭成+高继海

摘要：以广元市旺苍县4个样区136份杜仲树皮为试材，采用HPLC法测定其绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷含量，活立木树皮产量测算方法测算树皮产量，研究杜仲树皮产量及活性成分含量与树龄、株高、胸径及皮厚的相关性，为旺苍县杜仲优良品种的选育提供有效参考。结果表明：4个样区的杜仲树皮绿原酸含量0.079%～1.208%，松脂醇二葡萄糖苷含量0.068%～5.251%，树皮平均年产量0.03～2.56 kg。树龄为6～28年杜仲树皮，活性成分含量主要与树龄、胸径呈负相关，产量与树龄、株高、胸径、皮厚呈正相关。因此，可以将树龄和胸径2个指标优先纳入旺苍县优良杜仲的选育工作中。

关键词：杜仲树皮；活性成分；产量；生长指标；相关性分析

中图分类号：S567.1+90.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0055-05

Abstract Using 136 bark samples from 4 areas of Wangcang County， Guangyuan City， the correlations of bark yield and active ingredient contents with age， plant height， diameter at breast height and bark thickness of Eucommia ulmoides were studied to provide references for breeding good varieties. The content of active ingredients in E. ulmoides barks was determined by HPLC method， and the bark yield was calculated in the alive condition. The results showed that the content of chlorogenic acid and pinoresinol diglucoside in E. ulmoides barks was 0.079%～1.208% and 0.068%～5.251% respectively， and the average annual bark yield was 0.03～2.56 kg. In the 6～28-year-old samples， the content of active ingredients was mainly negtively correlated with plant age and diameter at breast height， and the bark yield was positively correlated with the age， plant height， diameter at breast height and bark thickness. Therefore， tree age and diameter at breast height could be chosen as the prior indexes for variety breeding.

Keywords Eucommia ulmoides bark； Active ingredient； Yield； Growth and development characters； Correlation analysis

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）為杜仲科杜仲属植物，分布于我国秦岭、黄河以南、五岭以北、黄海以西及云南高原以东区域，其间基本上是长江中下游流域[1]。其树皮别名丝绵皮、玉丝皮，是我国特色的名贵中药材[2]。杜仲在《神农本草经》中被作为上品药物，具有降血压、抗氧化、抗疲劳、增强免疫力、抗骨质疏松症、抗肿瘤、护肝、降血糖、抗衰老等功效[3]。

杜仲在我国的应用历史长达两千多年[4]，但其资源已遭到严重破坏，杜仲大树几乎被毁殆尽[5]，目前已被国家列入重点保护对象。国外于19世纪末开始引进杜仲，20世纪对其应用研究开始快速发展[6]。我国学者于20世纪80年代初，针对杜仲产量、抗逆性等方面，已对杜仲资源的选育工作进行了研究[7]。但由于我国杜仲分布广泛，对其选育工作尚未系统开展[8]，且尚未将功效活性成分纳入其资源优选指标。因此，本研究测定了杜仲树皮的活性成分及产量，并分析其与树龄、株高、胸径、皮厚的关系，以期更好地了解杜仲树皮产量及活性成分含量的影响因素，并将活性成分作为优选指标应用到杜仲选育工作中，为当地杜仲的采收及选育工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）、KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱（美国安捷伦科技有限公司）、SW-02A多功能粉碎机（广州泰丰）、UPT-II-10T优普超纯水机（成都超纯科技有限公司）、CPA225D电子天平（德国Sartorius）。

试剂：甲醇、乙腈为色谱纯，购自成都思为科学仪器有限公司。磷酸为优级纯，购自成都市科龙化工试剂厂。绿原酸对照品（CAS：327-97-9，纯度为98%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司，松脂醇二葡萄糖苷对照品（批号：MUST-16060722，纯度为97.5%）购自成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 材料

杜仲树皮采自广元市旺苍县亿明生物科技有限公司杜仲种植基地，分别从同一个产区4个不同海拔样区（海拔572.0 m，106°18′7″E，32°13′43″N；海拔534.4m，106°18′16″E，32°13′42″N；海拔552.1 m，106°18′16″E，32°13′42″N；海拔520.3 m，106°17′1″E，32°13′51″N）采集，林下植被均为草本植物，土壤为红砂土，地貌为山地缓坡。每个样区随机采集20～35株杜仲的树皮，总计136份样品，树龄在6～28年之间，经成都中医药大学药学院严铸云教授鉴定，为杜仲科杜仲属植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）的树皮，编号后常温干燥保存。部分样品指标见表1。endprint

1.3 绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷含量测定方法

1.3.1 色谱条件参照刘慧等[8]的方法并改进：色谱柱：Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相A：乙腈；流动相B：0.1%磷酸水溶液。LC结束时间60.01 min；检测波长为235 nm；总流速为1.00 mL/min；进样量为10 μL；柱温30℃。采用梯度洗脱：0.01～7.00 min，93%B；7.00～35.00 min，86%B；35.01～45.00 min，85% B；45.01～60.00 min，93%B。

1.3.2 对照品溶液的制备分别精密称取绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷对照品2.62、1.83 mg置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成0.524 mg/mL的绿原酸以及0.366 mg/mL的松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液，置于4℃冰箱中冷藏保存备用。

1.3.3 样品溶液的制备取适量样品置于粉碎机中粉碎至絮状，精密称取1 g置于100 mL锥形瓶中[8]，同时精密量取25 mL 60%的甲醇溶液置于具塞锥形瓶中。超声提取40 min后，称重，用60%的甲醇溶液补足减少的质量。振荡后用0.45 μm的滤膜过滤，取1.6 mL左右滤液至进样瓶中得到供试品溶液。

1.3.4 标准曲线的绘制分别取1.3.2中对照品溶液0.1、0.5、0.6、0.8、1.0、2.0 mL至5 mL容量瓶中，甲醇定容。将对照品溶液经0.45 μm滤膜注入进样瓶，按照1.3.1的方法进行分析。以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，得出回归方程。

1.3.5 样品测定将样品溶液按照1.3.1色谱条件进行HPLC分析，测定样品溶液中的绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的峰面积，将样品色谱图与标准品色谱图比较，利用两者的回归方程计算相应成分的质量浓度。

1.4 产量计算方法

树皮产量计算参照叶萌等[9]的方法进行。剥下适量杜仲树皮后，计算鲜树皮物理密度（树皮单位材积的重量），并计算待测植株的树皮材积，二者乘积即杜仲树皮产量。

杜仲树皮的长、宽、树干直径均由皮尺测量，鲜重采用EL-2JK高精度电子天平称量，厚度采用YG142-2/3型手提式测厚仪测定，高度采用克里斯屯测高器测量（广元亿明生物科技有限公司测得）。

1.5 数据处理

数据采用Microsoft Excel软件进行统计，SPSS 18軟件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 标准品与样品的色谱图

在1.3.1色谱条件下，松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸及其它峰分离较好，见图1。

2.2 标准曲线及线性关系

以峰面积为纵坐标，对照品和样品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线（图省略），计算得到绿原酸的回归方程为 y=7000000x-17307，r=0.9999，线性范围为0.01048～0.2096 mg·mL-1；松脂醇二葡萄糖苷的回归方程为y=2000000x-14883，r=0.9992，线性范围为0.00732～0.1464 mg·mL-1。说明二者线性关系均较好。

2.3 样品中绿原酸及松脂醇二葡萄糖苷的含量

部分检测结果见表2。4个样区的杜仲树皮绿原酸含量为0.079%～1.208%，松脂醇二葡萄糖苷含量为0.068%～5.251%，后者波动较大，总体趋势上两者的含量都随着树龄的增大而降低。

2.4 杜仲树皮产量计算结果

4个样区的杜仲树皮年产量为0.03～2.56 kg，平均为1.05 kg，该批次总体趋势上随树龄、株高、皮厚、胸径的增大而增大。部分样品的产量结果见表3。

2.5 杜仲树皮产量及活性成分含量与树龄、皮厚、株高、胸径的相关性分析

由表4可知，杜仲树皮绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷含量与树龄、胸径均分别呈极显著、显著负相关，与皮厚、株高无显著相关性。年产量与树龄、皮厚、株高、胸径均呈极显著正相关，其中，年产量与株高的相关系数最大。

3 讨论与结论

绿原酸与松脂醇二葡萄糖苷为杜仲重要的功效活性成分之一，研究表明，绿原酸具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、保肝等作用[11]，而松脂醇二葡萄糖苷具有降血压的功效。因此，绿原酸与松脂醇二葡萄糖苷含量与生长指标的相关性研究是选育工作关键之处。分析结果表明，总体趋势上，杜仲树龄在6～28年的时候绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷的含量随树龄、胸径的增大而降低。

马金花等[12]关于杜仲叶的研究结果显示：光合作用产生的淀粉降解后成为苯丙烷类代谢途径的前体物质，而绿原酸是该代谢过程中的一种苯丙素类化合物，随着树龄增大，树叶光合作用减弱，树叶中的绿原酸含量降低。由于树皮不进行光合作用，树叶中的绿原酸含量远高于树皮[13]，因此可以推测杜仲树皮中的绿原酸含量与树叶中的含量可能有一定联系，即随着树叶中的绿原酸不断累积，一部分向树皮转移；当树龄增大时，树叶的光合作用减弱，绿原酸含量降低，从而导致树皮中的绿原酸含量降低，由于树干及树皮均不进行光合作用，所以皮厚、株高对绿原酸含量的影响不显著。因此，杜仲树皮中绿原酸的含量主要与树龄有关。松脂醇二葡萄糖苷属于双环氧类木脂素，是杜仲药材质控的重要指标[14]。植物体内木脂素类化合物是由苯丙烷类化合物合成转化所得[15]。绿原酸是苯丙烷类次级代谢过程中关键的中间化合物之一，其含量降低有可能导致木脂素合成减少，最终导致松脂醇二葡萄糖苷化合物的生物合成减少。此外，木质素也是由苯丙烷类代谢途径的产物合成[16]，随着树龄、胸径的增加，更多苯丙烷类代谢途径的产物用于合成木质素，由于杜仲自身代谢有限，可能导致松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸合成减少。endprint

杜仲树皮的平均年产量即生物累积量，是衡量树种优劣和药材产量的重要指标，直接关系药农的经济收入。本研究结果表明，杜仲树皮的年产量与树龄、皮厚、株高、胸径均呈极显著相关，其中与株高的相关性最大（r=0.898），其次是胸径。因此在这批样品中，株高对树皮产量的影响最大。

参考文献：

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[8]刘慧，张盛，刘仲华. HPLC法同时测定杜仲皮中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷[J]. 中草药， 2012， 43（8）：1547-1549.

[9]叶萌，邓辉洪，庄国庆. 厚朴活立木树皮产量测算方法： CN104316101A[P]. 2015.

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