具有除草活性的海洋放线菌筛选与鉴定

刘兆良+袁忠林+周长健+罗兰

摘要：以小麦为初筛靶标生物，筛选到3株对其生长具有抑制作用的海洋放线菌。采用平皿法以反枝苋、生菜和黄瓜为供试植物，测定3株海洋放线菌的除草活性。结果表明，菌株SLR2、GC3、AF2发酵液的上清液对反枝苋、生菜和黄瓜的种子幼根和幼芽具有较强的抑制作用，其中3种菌株发酵液的上清液对反枝苋幼根和幼芽的抑制率为100%，5倍稀释液对反枝苋的抑制率均在50%以上；SLR2、GC3发酵液的上清液对生菜生长的抑制率为95.1%～100%和80.9%～100%；SLR2发酵液的上清液对黄瓜生长的抑制率为73.8%～77.4%。根据形态特征和16S rDNA 序列分析，将SLR2、GC3和AF2鉴定为原小单孢菌Promicromonospora umidemergens、浅多色链霉菌Streptomyces pluricolorescens和小链霉菌Streptomyces parvus。

关键词：海洋放线菌；除草活性；筛选；鉴定

中图分类号：S476.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0063-06

Abstract Three marine actinomyces with inhibitory effect on the growth of wheat were screened. The herbicidal activity of the three strains were determined using the plate method and with Amaranthus retroflexus， Lactuca sativa and Cucumis sativus as the tested plants. The results showed that there were obvious inhibitory effects of SLR2， GC3 and AF2 fermentation supernatant fractions on young root and bud growth of A. retroflexus， L. sativa and C. sativus. The inhibition rates of SLR2， GC3 and AF2 fermentation supernatants on young roots and buds of A. retroflexus were all 100%， and those of their five times supernatant diluents were more than 50%. The inhibition rates of SLR2 and GC3 fermentation supernatants on L. sativa were 95.1%～100% and 80.9%～100%， respectively， and those of SLR2 fermentation supernatants on C. sativus were 73.8%～77.4%. Based on the 16S rDNA sequence and physiological properties， the strain SLR2， GC3 and AF2 were identified as Promicromonospora umidemergens， Streptomyces pluricolorescens and Streptomyces parvus respectively.

Keywords Marine actinomycetes； Herbicidal activity； Screening； Identification

雜草严重危害农作物的生长和发育，每年造成的损失约占世界粮食总产量的10%[1，2]。化学除草剂具有高效、快速、经济的优点，同时也带来了环境污染、杂草抗性等诸多问题[3-5]。因此，开发新型生物源除草剂已成为研制新农药的热点。

生物源除草剂以资源丰富、毒性小、残留少、环境兼容性好、经济效益高等优于化学除草剂的特点，逐步引起人们的重视[6-8]。有关放线菌或其分泌物被开发为商品作为除草剂应用于农业生产中的最早例子双丙胺磷（double propylamine phosphorus）就是产绿色链霉菌（Streptomyces viridocbromogenes）的产物，已经在日本开始商品化生产并销售，用来防治果园和非耕地一年或多年生杂草[1]。上海农药研究所发现的放线链霉菌产生的两类环己酰亚胺物质具有极强的除草活性，其发酵液的稀释液处理野苋苗后的防效可达100%[9]。龙建友等[10]从陕西秦岭山区采集的土壤中分离得到一株链霉菌属（Streptomyces sp.）的放线菌，其发酵液和离子交换液对反枝苋种子的萌发、主根和主茎生长抑制率分别为26.7%、80.6%、66.5%和42.9%、93.1%、86.2%，且经HPLC得到的8个馏份中，馏份4的除草活性最强。魏松红等[11]从辽宁省6个地区蔬菜田采集的29份土样中分离得到138株放线菌，利用种子萌发法筛选出对马唐种子萌发具有显著抑制活性的SYM-2菌株，其校正抑制率达71.43%；发现其优化后的发酵液的校正抑制率显著高于其他各组。宗志友等[12]对放线菌612243菌株的除草活性成分进行了分离与鉴定，获得一个活性化合物612243-B，经过分析发现该化合物与已知的葡糖基杀粉蝶菌素（glucopiericidin A）相同。薛章荣等[13]对浅灰链霉菌CGMCC1370除草活性成分进行了研究，种子萌发试验表明，在1 mg/L浓度下，该化合物可以抑制多种作物种子的萌发；盆栽试验发现，在有效成分75 g/hm2剂量下，其对供试阔叶杂草的抑制率高达96.0%～100.0%；作物安全试验结果表明，即使在2 000 g/hm2下其对花生和小麦依然安全。薛陕等[14]从实验室保存的海洋微生物中筛选出2株具有除草活性的海洋放线菌，其中1株还具有杀虫和抑菌活性。徐守建[15]对海洋微生物的农用活性也进行了初步研究，筛选出抑菌效果最好的一株海洋细菌并分析其活性物质，该活性化合物除对茄交链孢菌等多种植物病原真菌具有更显著的抑制作用外，还具有较强的除草活性。杨娟[16]从479株海洋微生物中筛选得到1株除草活性较强的Ha1菌株，其粗提物对马唐和莱茵衣藻具有较强的活性，并对除草活性物质进行了分离和纯化，研制出了菌株活体颗粒剂，发现添加助剂的颗粒剂对马唐的抑制活性总是高于未添加助剂的，添加助剂的对马唐的抑制率由90%下降到50%，而未添加助剂的抑制率由83%下降到23%。endprint

目前用于生物除草剂开发的微生物主要来自陆源微生物，有关海洋微生物对杂草活性筛选的研究虽然取得了一定进展，但还不够深入和系统，特别是海洋微生物代谢产物作为除草剂具有许多潜在优势。本实验室从青岛海域采集样品，分离筛选出具有杀虫活性的18株海洋放线菌[17]，在以小麦为靶标生物进行初筛的基础上，对反枝苋、生菜和黄瓜进行了生物活性测定，以进一步筛选具有除草活性的海洋放线菌，为除草活性物质深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株为18株海洋放线菌，详见图1，由青岛农业大学农学与植物保护学院农药学实验室从青岛附近海域的海水、海沙和海洋漂浮物等中分离获得，现保存于本实验室。

1.2 培养基

菌种的活化用改良的海水高氏一号培养基，其配方为：可溶性淀粉20 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20 g，海水1 000 mL。菌株发酵用黄豆粉培养液，其配方为：葡萄糖5.0 g，可溶性淀粉20 g，酵母膏2.5 g，新鲜的黄豆粉15 g，CaCO3 1.0 g，蒸馏水1 000 mL[17]。

1.3 供试植物种子

小麦（Triticum aestivum）为‘青麦6号，由青岛农业大学农学与植物保护学院提供；黄瓜（Cucumis sativus）为‘鲁黄瓜3号，生菜（Lactuca sativa）为抗熟‘绿湖黑核西生菜，均购自城阳种子市场；反枝苋（Amaranthus retroflexus）采自青岛农业大学校园内。

1.4 菌株发酵及上清液的制备

参照刘志航等[17]的方法将活化的放线菌接种到改良的高氏一号培养基上，28℃培养5 d，然后用直径4 mm打孔器打取菌块接种于装有50 mL液体培养液的250 mL锥形瓶中，3块/瓶。28℃、160 r/min发酵5 d。发酵液经10 000 r/min离心15 min，取上清液，4℃保存，备用。

1.5 除草活性菌株的筛选及其生物活性测定

1.5.1 除草活性菌株的筛选 采用平皿法进行除草活性测定[18]。将供试小麦种子保湿催芽，等露白后将种子放入海洋放线菌的发酵上清液中，10粒/皿，重复3次，同时设露白种子放在清水中为对照，27℃恒温培养，3 d后测定植株的根长和芽长，计算幼根长和幼芽长抑制率。

幼根长抑制率（%）=（对照组幼根长-处理组幼根长）/对照组幼根长×100

幼芽长抑制率（%）=（对照组幼芽长-处理组幼芽长）/对照组幼芽长×100

1.5.2 除草活性菌株的生物活性测定 选用黄瓜、生菜和反枝苋种子，放入1.5.1中筛选出的除草活性菌株发酵上清液及5倍稀释液中进行测定。其它方法同上。

1.5.3 数据处理 所得数据使用SPSS 21.0进行单因素方差分析，用Duncans法进行差异显著性分析。

1.6 除草活性菌株的鉴定

1.6.1 培养特征和形态观察 将筛选出的菌株SLR2、GC3和AF2接种到改良的海水高氏一号培养基上，28℃恒温培养7 d，观察菌株的气生菌丝和基内菌丝颜色、是否产生可溶色素等培养特征[20]。利用插片法对具有活性的菌株进行形态观察。将灭菌盖玻片以45°斜角插入待观察菌培基中，28℃培养5～7 d后，取出盖玻片，在显微镜下直接观察气生菌丝和孢子丝的形态[19，20]。

1.6.2 16S rDNA 序列分析及系統发育树构建 利用上海生工DNA快速抽提试剂盒进行SLR2、AF2和GC3菌株基因组DNA的提取，并以此为模板进行PCR扩增。引物为细菌16S rDNA序列分析所用引物：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。产物经检测由上海生工生物工程有限公司测序。将获得序列进行BLAST比对，采用MEGA 6.0软件构建系统发育树，确定菌株的分类地位[21]。

2 结果与分析

2.1 除草活性菌株的筛选

参照文献[14]进行发酵液的稀释，采用平皿法测定18株海洋放线菌发酵上清液对小麦生长的影响。图 1和图2结果表明，有16个海洋放线菌菌株的发酵上清液对小麦幼根的生长有不同程度的抑制作用，有12个菌株的发酵上清液对小麦幼芽的生长有不同程度的抑制作用，其中SLR2、AF2和GC3三个菌株的发酵上清液对小麦幼根和幼芽生长抑制效果较强。

2.2 菌株的除草活性

由表1可知，SLR2、GC3和AF2菌株发酵上清液对黄瓜、生菜和反枝苋的生长均具有不同程度的抑制作用。其中，SLR2对反枝苋幼根和幼芽抑制率均达100%，对生菜幼根和幼芽抑制率在95%以上，对黄瓜幼根和幼芽的抑制率在70%以上。AF2对反枝苋幼根和幼芽抑制率均达100%，对黄瓜幼根和幼芽抑制率在75%以上。GC3对反枝苋幼根和幼芽抑制率均达100%，对生菜和黄瓜幼根和幼芽抑制率均在80%以上。发酵上清液稀释5倍后对靶标植物生长的抑制率均明显降低。SLR2发酵上清液对反枝苋和生菜幼根和幼芽的抑制效果见图3。

2.3 菌株SLR2、GC3和AF2的分类鉴定

2.3.1 培养特征和形态观察 菌株SLR2在改良的海水高氏一号培养基上菌落较小、微凸，周围放射状，初始菌落为白色，可产生黄色可溶性色素，后期变成黄色（图4A）。基内菌丝和气生菌丝在生长后期均断裂，气生菌丝少或生长不好，有的在基丝或短柄上产生单个孢子（图4B）。菌株SLR2的形态特征与文献[22]中原小单孢菌属（Promicromonospora）基本符合，初步确定SLR2为原小单孢菌。endprint

菌株AF2在改良的海水高氏一号培养基上形成丰富的白色至灰色的气生菌丝和淡黄色至深褐色基内菌丝，菌落表面干燥，有褶皱，可产生黄色至深褐色的可溶性色素（图5A）。产生柔曲的孢子丝并形成大量的椭圆形孢子（图5B）。

菌株GC3在改良的海水高氏一号培养基上形成白色至灰色气生菌丝和黄色的基内菌丝，并产生黄色可溶性色素（图6A）。显微观察发现有孢子丝及大量孢子，均为菌丝断裂形成（图6B）。菌株AF2和GC3的形态特征与文献[22]中链霉菌属（Streptomyces）基本一致，初步确定AF2和GC3为链霉菌。

2.3.2 16S rDNA 序列分析 菌株AF2、GC3和SLR2的16S rDNA序列长度分别为1 368、1 339、1 346 bp，经BLAST比对，菌株AF2与小链霉菌（Streptomyces parvus）（登录号：KU317906）的相似性达100%。菌株GC3与浅多色链霉菌（Streptomyces pluricolorescens，登录号：KU324442）的相似性达100%。菌株SLR2与原小单孢菌（Promicromonospora umidemergens，登录号：JN180234）的相似性达99%以上。将菌株AF2、GC3和SLR2与参照菌株序列一起构建系统发育树，菌株AF2

与Streptomyces parvus在同一分支上，菌株SLR2与Promicromonospora umidemergens聚类到一起，菌株GC3与Streptomyces pluricolorescens相邻（图7）。结合形态学特征，将菌株AF2、GC3和SLR2分别鉴定为Streptomyces parvus、Streptomyces pluricolorescens和Promicromonospora umidemergens。

3 讨论与结论

目前已有很多关于除草活性放线菌筛选的研究报道[10-16]。本研究从18株海洋放线菌中筛选出对小麦、黄瓜、反枝苋和生菜生长具有较强抑制作用的3株放线菌，经培养特征、形态观察及16S rDNA序列分析，将AF2鉴定为小链霉菌S. parvus，GC3鉴定为浅多色链霉菌S. pluricolorescens，SLR2鉴定为原小单孢菌P. umidemergens。

链霉菌在自然界中分布广泛，具有多种生物活性。刘伟等[23]对海洋小链霉菌DY2741中的抗菌物质分离纯化，初步判断该组分为邻苯二甲酸二丁酯（DBP），该成分为小链霉菌DY2741的主要抗菌物质之一。田兆丰等[24]对小链霉菌Yn168的抗病毒成分分离研究，发现为小分子的蛋白质。陈井生等[25]对分离于大豆田的放线菌进行了抗南方根结线虫活性测定，结果表明H-2菌具有较高的选择性杀线虫活性，初步鉴定H-2菌株为小链霉菌（S. parvus）。Rao等[26]还报道了S. parvus产生的脂肽是抗细菌的主要成分。孙建龙等[27]报道小链霉菌PH33对番茄溃疡病菌有拮抗能力。浅多色链霉菌S. pluricolorescens也有抑菌活性的相关报道[28，29]。本研究从海洋分离的小链霉菌、浅多色链霉菌和原小单孢菌具有抑制植物生长的作用，即具有除草活性。同类研究还未见报道，故而具有新颖性，值得深入研究。

海洋放线菌作为一个新兴的领域，能够产生多种新颖的化合物，其除草活性以及抗病机制的研发前景非常可观。虽然本文只是除草活性的初步筛选研究，但对以后田间除草效果、除草活性成分的分离与鉴定，对青岛海域具有生物活性海洋放线菌的研究，以及利用海洋放线菌研制新型药物奠定了一定的理論和实践基础。菌株SLR2、GC3和AF2生物活性物质的分离及其他生物活性还有待进一步探究。

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