水蛭通过p38MAPK信号通路对早期动脉粥样硬化大鼠VSMCs的影响

吴晶魁+杨乔 李洋洋

[摘要]為了探究中药水蛭干预作用下p38MAPK信号转导通路对早期动脉粥样硬化（AS）大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖与凋亡的影响及其可能机制。实验通过生化分析仪检测中药水蛭对大鼠血脂（TG，TC，LDLC，HDLC）水平的调控；ELISA检测血清中TGFβ1的水平；免疫组织化学法（IHC）检测VSMCs的PCNA，Caspase3表达水平；Western blot检测中药水蛭对VSMCs中MKK3，p38及Cmyc蛋白表达的影响；HE染色观察大鼠胸主动脉形态变化。结果显示，中药水蛭可使TC，LDLC明显降低，HDLC升高，TGFβ1，PCNA的表达水平明显下降，Caspase3表达上调，MKK3，p38及Cmyc蛋白表达水平下降，以及抑制内膜增厚、减少斑块形成。以上结果表明中药水蛭可能通过调降血脂，降低TGFβ1水平，影响p38MAPK信号通路蛋白表达，从而抑制VSMCs的增殖、促进其凋亡，抑制内膜增厚、减少斑块形成等环节，进而干预早期AS进程。

[关键词]水蛭；动脉粥样硬化；p38MAPK信号通路；血管平滑肌细胞；增殖与凋亡

Effect of leech on VSMCs in early atherosclerosis rats via

p38MAPK signaling pathway

WU Jingkui1， YANG Qiao1*， LI Yangyang2， XIE Dongjie1

（1Tianjin Medical University General Hospital， Tianjin 300052， China；

2The First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China）

[Abstract]To explore the effect of leech on proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells（VSMCs） in early atherosclerosis rats via p38MAPK signaling pathway and investigate its possible mechanism Biochemical analyzer was used to examine the regulation of leech on levels of triglycerides（TG）， total cholesterol（TC）， lowdensity lipoprotein（LDLC）， and highdensity lipoprotein（HDLC） in blood lipid of rats The expression of transforming growth factorbeta 1（TGFβ1） in serum was detected by ELISA Immunological histological chemistry （IHC） was taken to measure the expression levels of proliferating cell nucleus antigen（PCNA） and cell apoptosis proteinase3（Caspase3）， while the protein expression levels of MKK3， p38 and Cmyc were detected by Western blot In addition， hematoxylin and eosin（HE） staining was used to observe the morphological change of thoracic aortas The results showed that leech decreased the levels of TC， LDLC obviously and increased HDLC， suppressed the expression levels of TGFβ1 and PCNA， upregulated Caspase3， downregulated the expression levels of MKK3， p38， and Cmyc protein HE staining indicated that it could inhibit intimal thickening and reduce plaque formation The above results indicated that leech may affect the protein expression of the p38MAPK signaling pathway to inhibit proliferation and promote the apoptosis of VSMCs via reducing blood lipid levels and suppressing TGFβ1， aiming at inhibiting intimal thickening and reducing plaque formation， tand then slowing down the process of early atherosclerosis

[Key words]leech； atherosclerosis； p38MAPK signaling pathway； vascular smooth muscle cells； proliferation and apoptosisendprint

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的激活、迁移与增殖是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发生的重要病理过程[1]。一般情况下，VSMCs保持静止，即处于不增殖的状态[2]，但是在血管损伤后VSMCs将会异常增殖，同时引起早期AS病理改变[3]。有研究指出，VSMCs增殖与凋亡的失衡是AS发生过程中斑块形成的的重要环节[4]。转化生长因子β1（transforming growth factorbeta1，TGFβ1）具有激活细胞内信号转导通路以及促进细胞增殖、分化的作用[5]。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase，p38MAPK）是调控细胞增殖与死亡的重要通路，可参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程[6]，TGFβ1作为外在刺激因子，对p38MAPK信号通路的激活具有重要作用[7]。血管壁的组成细胞主要包括VSMCs和内皮细胞，成熟的内皮细胞不具有增殖活性，因此在早期AS的发生主要为VSMCs增殖所致；增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）[8]是细胞基因复制、修复及细胞周期控制的基本蛋白，为细胞增殖的一种可靠标志物，所以在早期AS过程中PCNA含量的变化与VSMCs异常增殖保持一致。AS发生过程中也存在VSMCs的凋亡，而细胞凋亡蛋白3（Caspase3）是细胞凋亡通路中一种关键的执行蛋白，在细胞凋亡过程中具有重要的作用，胞浆中活化后的Caspase3能够裂解相应的胞浆及胞核底物，最终导致细胞凋亡[9]。

中药水蛭（leech）最早记载于《神农本草经》：“主逐恶血、瘀血、月闭、破血瘕积聚……利水道”，水蛭味咸、苦、平，有破血逐瘀，通经消癥的功效。对不稳定型心绞痛、心肌梗死、高脂血症、冠状动脉支架术后再狭窄等多种心血管疾病具有较好的临床疗效[10]。

本课题组对脉血康胶囊（内容物为单药水蛭粉）的前期实验结果表明，中药水蛭具有调节脂质代谢、减轻氧化损伤、保护血管内皮、抑制炎症反应等作用[1112]，同时可抑制VSMCs表型转化、增殖和迁移[13]。本实验通过观察中药水蛭干预早期AS大鼠，检测VSMCs增殖与凋亡及p38MAPK信号通路蛋白等指标，探究中药水蛭干预下p38MAPK信号通路对VSMCs增殖与凋亡的影响及抗AS的作用机制。

1材料

11动物健康雄性Wistar大鼠40只，SPF级，体质量（175±20） g，购于中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心，许可证号SCXK（军）20160001。

12药物及试剂本实验所用中药水蛭为脉血康胶囊内容物（贵州信邦制药股份有限公司提供，批号20160406）；高脂饲料[配方：729%普通饲料，2%胆固醇，01%胆盐，5%蔗糖，10%猪油，10%蛋黄粉，合格证号SCXK（京）20140008，批号20160410]及普通饲料（合格证号SCXK（京）20060006，批号20160310）订购于北京华阜康生物科技股份有限公司；维生素D3注射液（上海通用药业股份有限公司，批号130107）；医用水合氯醛（批号20160426）由天津医科大学总医院提供；TGFβ1酶联免疫吸附（ELISA）测定试剂盒（货号EK0514）、大鼠抗PCNA（货号BM0104）、Caspase3单克隆抗体（货号BA2142）及链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物（SABCPOD）免疫组化试剂盒（货号SAl020）与DAB显色试剂盒棕黄（货号AR1022）购于武汉博士德生物公司；血脂试剂盒（德国罗氏诊断有限公司）；兔抗MKK3、抗p38（D13E1）、抗Cmyc（D3N8F）单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司，貨号分别为5674s，8690s，13987s）；βactin抗体（美国Santa Cruz公司，货号SC47778）。

13仪器TL18M台式高速冷冻离心机（上海离心机械研究所）；Modular P全自动生化分析仪（德国罗氏诊断有限公司）；Tecan Safire酶标仪（瑞士）；TU1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Olympus BX51正置荧光显微镜及图像采集系统（日本）；Research plus移液枪（德国Eppendorf）；EPS300电泳/电转装置（上海天能科技有限公司）；Chemi Scope 6300化学发光成像仪（上海勤翔科学仪器有限公司）；TS100摇床（其林贝尔仪器制造有限公司）。

2方法

21动物分组及处理40只Wistar大鼠适应性喂养1周后，采用数字随机表法将大鼠分为4组：正常对照组、模型对照组、水蛭粉低、高（06，12 g·kg-1）剂量组，每组各10只。随即对模型组、水蛭高、低剂量组大鼠一次性腹腔注射维生素D3注射液60万IU·kg-1，同时给予高脂饲料喂养；对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水，给予普通饲料喂养。第2天将配好的中药水蛭药液按照规定剂量（10 mL·kg-1）分别对水蛭干预组进行灌胃，同时对照组和模型组给予等量蒸馏水灌胃，每天1次，连续灌胃8周。每周末称大鼠体质量1次以调整灌胃量。

22血清指标检测实验末，各组大鼠禁食不禁水12 h，次日清晨腹腔注射10%水合氯醛（3 mL·kg-1）进行麻醉，麻醉满意固定好后剖开腹腔，腹主动脉取血6 mL，迅速4 ℃下以3 000 r·min-1离心10 min，用移液枪将上层血清分装于冻存管中放入-20 ℃冰箱中保存待检测。①取部分血清复温，于全自动生化分析仪上检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）；②另取各组大鼠部分血清复温，按ELISA试剂盒说明书要求测定血清TGFβ1含量。endprint

23主动脉病理学观察取血后，分离出主动脉弓并剪取05 cm，生理盐水洗净血迹后放入10%中性福爾马林溶液固定，以备制作石蜡切片（4～5 μm）。每组随机选取7个大鼠主动脉弓标本，每一标本取一张石蜡切片进行苏木精和伊红（HE）染色，200倍光镜下观察主动脉的形态。

24免疫组织化学法检测PCNA，Caspase3的表达选取已制作好的石蜡切片（每组各7个标本），每一标本PCNA，Caspase3指标各染2张片；按SABC免疫组化试剂盒说明书进行操作，大鼠PCNA，Caspase3对应抗体分别按1∶100及1∶150稀释作为一抗，显二管DAB显色，封片。免疫组化完成后，将各指标染色切片于400倍光镜下观察5个不重叠视野并拍照。使用ImagePro Plus 60软件测量分析VSMCs分布区域面积（area）和其所在范围内PCNA，Caspase3阳性染色积分光吸收度（A），最后用每个标本的平均光密度值（A/area）进行半定量分析。

25Western blot检测MKK3，p38，Cmyc蛋白的表达剪取剩余胸主动脉，分段放入冻存管于液氮中迅速冷冻，后转入-80 ℃冰箱保存待检测。各组随机取7个冷冻标本，复温后用预生理盐水漂洗去除血迹，超声破碎，取裂解液，加入上样缓冲液，混匀，取离心后的样本上样，按照电泳程序进行电泳。电泳结束后，转膜。转膜结束后，取下膜，浸没在5%牛奶中封闭1 h，之后按照说明书使用要求加一抗，于4 ℃孵育过夜。洗涤，孵育二抗，室温孵育1 h。洗涤3次显色，曝光。使用Image J软件对MKK3，p38，Cmyc蛋白条带进行灰度值计算，与内参比较，分析相对蛋白表达量。

26统计学方法采用SPSS 220统计软件进行统计学分析，先对各数据进行正态性检验，计量资料以±s表示；多组资料组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）：方差齐时，组间比较采用LSD检验，方差不齐时采用Tamhane′s T2检验；P<005或P<001为差异具有统计学意义。

3结果

31中药水蛭对早期AS大鼠血脂水平的影响各组TG差异不明显，无统计学意义；与对照组比较，模型组TC和LDLC显著升高，HDLC降低，差异有统计学意义（P<001）；与模型组比较，水蛭各干预组的TC和LDLC明显降低，差异具有统计学意义（P<001），水蛭低剂量组较高剂量组有所降低，但差异无统计学意义；水蛭2个干预组较模型组HDLC有升高趋势，差异有统计学意义（P<001），2组间HDLC无明显差异，见表1。

32中药水蛭对早期AS大鼠血清TGFβ1表达水平的影响模型组TGFβ1较对照组明显升高，差异有统计学意义（P<001）；水蛭各干预组TGFβ1明显较模型组降低，差异均具有统计学意义（P<001）；2个水蛭干预组组间差异不明显，无统计学意义，见表2。

33中药水蛭对早期AS大鼠VSMCs的PCNA，Caspase3表达影响模型组的PCNA较对照组明显升高，差异有统计学意义（P<001），Caspase3轻度升高，但差异无统计学意义；水蛭各干预组额PCNA较模型组明显降低，Caspase3明显升高，差异均具有统计学意义（P<001）；与水蛭低剂量组相比，水蛭高剂量组PCNA有所升高，Caspase3有所降低，但差异无统计学意义，见表3，见图1，2。

34中药水蛭对早期 AS大鼠VSMCs中MKK3，p38，Cmyc蛋白表达影响的Western blot检测与对照组相比较，模型组的p38和Cmyc蛋白表达增加，差异具有统计学意义（P<001），MKK3表达水平差异不明显，无统计学意义；水蛭各干预组的MKK3，p38，Cmyc蛋白表达明显较模型组降低，差异具有统计学意义（P<001）；与水蛭低剂量组比较，水蛭高剂量组的MKK3及Cmyc蛋白表达轻度增加，差异具有统计学意义（P<005），p38表达水平差异不明显，不具有统计学意义，见表4，图3。

35胸主动脉HE染色光镜下观察胸主动脉HE染色切片（200倍视野），可见对照组大鼠主动脉内膜完整、光滑，VSMCs排列整齐，未见明显胆固醇结晶沉积及斑块形成；模型组主动脉内膜不平整，可见明显向腔内凸起的斑块，内、中膜明显增厚，VSMCs增生、排列紊乱，可见胆固醇结晶沉积，明显斑块形成；水蛭各干预组主动脉病理改变较模型组均有不同程度减轻，可见水蛭低剂量组主动脉内中膜增厚较轻，内膜下少量斑块形成，斑块内有少量胆固醇结晶，VSMCs排列较整齐，水蛭高剂量组可见少量斑块及胆固醇结晶沉积，VSMCs排列较为整齐，斑块较少，见图4。

4讨论

本实验通过高脂饲料饲养及腹腔注射维生素D3建立早期AS大鼠模型，实验末，模型组大鼠血脂指标明显升高，HE染色观察胸主动脉血管壁形态，可见主动脉内膜增厚，凸向管腔的斑块，胆固醇结晶明显，表明建立早期AS大鼠模型成功。本实验中，各组TG水平无明显差异，可能与大鼠禁食12 h有关；模型组大鼠TC，LDLC较对照组明显升高，HDLC有降低趋势，表明中药水蛭可降低各干预组大鼠与AS发生相关的危险因素血清TC，LDLC水平，升高HDLC水平，与前期实验结果一致。TC，LDLC增高及HDLC的降低是AS发生的危险因素，LDLC可进入动脉壁，并刺激VSMCs增生，促使AS的发生，HDLC具有转运脂质的作用，是影响AS发生的保护因素；因此，以上实验结果表明中药水蛭可能通过调降早期AS大鼠的血脂水平，升高HDLC来影响AS进程。

VSMCs的增殖、分化受多种细胞因子和生长因子的调节影响[14]，如血小板源性生长因子（plateletderived growth factor，PDGF），TGFβ1，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNFα）等。AS的病理过程在于高血脂等危险因素引起血管内皮损伤诱发炎症，脂质沉着，VSMCs增殖参与损伤修复致内膜增厚，泡沫细胞聚集形成斑块[15]；TGFβ1是一种具有调节生长作用的多功能通道蛋白，有促进VSMCs增殖与分化的作用，实验证实，VSMCs在生长因子诱导刺激下，可发生从静止、收缩状态转变到增殖状态的血管病理改变[16]。通过HE染色切片观察模型组大鼠血管形态时可见血管内膜增厚，斑块形成明显，表明VSMCs增殖明显，同时模型组大鼠的血清TGFβ1较对照及中药水蛭各干预组明显升高，说明TGFβ1促进了VSMCs增殖。PCNA为细胞增殖的一种可靠标志物，在增殖活跃的细胞中表达明显，因此PCNA含量的变化与VSMCs增殖保持一致[8]，实验结果显示，模型组的PCNA表达水平明显较中药水蛭干预组高，表明模型组的VSMCs增殖程度较2个干预组高，因此可证实HE染色观察到的模型组胸主动脉内膜增厚及斑块形成明显与VSMCs增殖有关。早期AS发生发展过程中存在VSMCs增殖的同时还伴随着VSMCs的凋亡，研究[4]指出VSMCs增殖与凋亡的失衡是AS斑块形成的关键。Caspase家族包含众多成员（如Caspase2，Caspase3，Caspase4，Caspase8，Caspase9等），其中，Caspase3是细胞凋亡通路中的关键激活因子，其以酶原的形式存在于胞浆中，被Caspase9激活后能够裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡[17]。本实验中，中药水蛭各干预组Caspase3表达水平较模型组增高，模型组与对照组差异不大，表明中药水蛭各干预组VSMCs凋亡程度较模型组高；2个中药水蛭干预组的PCNA及Caspase3表达水平差异不明显，考虑为中药水蛭高低剂量的干预疗效差异不大，后期实验可调整给药量观察。从以上结果可推测，中药水蛭可能能够在一定程度上降低TGFβ1的表达而抑制VSMCs增殖，增加Caspase3的表达而促进VSMCs的凋亡，进而减轻血管内膜的增厚、减少胆固醇结晶沉积及斑块形成，从而起到减缓早期AS进展的作用。endprint

丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號转导通路可参与多种细胞的增殖、分化、凋亡等过程中，MAPK包含3种基本通路，即p38，ERK（extracellular regulated kinase），JNK（cJun Nterminal kinase ）[18]；其中，p38MAPK在炎症、应激、凋亡、细胞周期和生长的多种生理和病理过程中均发挥着重要作用[19]。MKK3/MKK6为p38MAPK信号通路公认的上游激酶[20]，通过直接磷酸化酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸残基激活p38，然后作用于下游的靶基因Cmyc等[21]，通过Cmyc调节细胞的增殖、分化及凋亡的过程[22]。本实验从p38MAPK信号通路上游激酶MKK3、中间蛋白p38以及下游靶基因（原癌基因Cmyc）出发，研究p38MAPK信号通路在对早期AS大鼠VSMCs的增殖与凋亡的调控作用，以及中药水蛭干预后相关蛋白的表达水平。研究结果显示，模型组的p38及Cmyc蛋白表达较对照组高，MKK3表达无明显差异，而中药水蛭各干预组的MKK3，p38及Cmyc蛋白表达水平明显低于模型组，同时，水蛭高剂量组MKK3及Cmyc蛋白表达水平较水蛭低剂量组轻度增高，但差异无显著性。从以上结果可知，中药水蛭可能能够降低p38MAPK信号通路中上游激酶MKK3、中间蛋白p38及下游原癌基因Cmyc蛋白表达水平。同时，TGFβ1可影响p38信号通路的激活[23]，进而影响VSMCs的增殖与凋亡等。从Wu H等[24]的研究中可知，VSMCs的增殖与迁移受到抑制时，伴随着p38蛋白表达水平的下降，表明p38蛋白表达与VSMCs增殖有关。本实验结果表明p38信号通路蛋白的表达水平与TGFβ1及VSMCs的增殖与凋亡指标呈一致性，因此推测中药水蛭可能通过干预p38MAPK信号通路蛋白的表达水平，调控VSMCs的增殖与凋亡来影响AS进程，从而起到抗AS的作用。

综上所述，AS的发生同VSMCs的增殖与凋亡失衡密切相关，中药水蛭可能能够调降血脂，降低TGFβ1表达、增加Caspase3的表达，通过p38MAPK信号通路调控抑制VSMCs增殖、促进其凋亡，减少血管内膜增厚、脂质浸润及斑块形成，进而减缓AS的进程。然而对于中药水蛭干预p38MAPK信号通路具体分子机制尚需进一步研究阐明。

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[責任编辑张宁宁]endprint