白头翁汤正丁醇提取物抑制白念珠菌细胞膜

胡唐玲 云云 徐志庆 +段强军 邵菁 汪天明 汪长中

[摘要]該文探讨白头翁汤正丁醇提取物（butyl alcohol extract of Baitouweng decoction，BAEB）对白念珠菌细胞膜的抑制作用。以Spot assay观察BAEB对白念珠菌细胞活性的影响；酶标仪检测BAEB干预后白念珠菌细胞内渗透压变化；荧光显微镜观察BAEB对白念珠菌细胞膜通透性的影响；高效液相检测白念珠菌细胞膜麦角甾醇的含量；qRTPCR法检测细胞膜麦角甾醇生物合成相关基因的表达。结果显示，256，512，1 024 mg·L-1BAEB干预下白念珠菌活性逐渐降低；512，1 024 mg·L-1BAEB组白念珠菌胞内甘油含量显著性增多（P<005），与白念珠菌胞内渗透压相关的基因HOG1分别下调91，93，55倍；512，1 024 mg·L-1BAEB组白念珠菌红色荧光细胞明显增多；1 024 mg·L-1BAEB干预后麦角甾醇峰面积为35884 95，有显著性差异（P<005）；1 024 mg·L-1BAEB干预组ERG1，ERG2，ERG3，ERG4，ERG5，ERG6，ERG10，ERG11，ERG13，ERG24，ERG25，ERG251，ERG26与UPC2 分别下调658，489，415，924，341，984，308，750，553，590，245，325，198，1007倍。BAEB可通过抑制麦角甾醇及其生物合成相关基因的表达，进而抑制白念珠菌细胞膜完整性。

[关键词]白头翁汤正丁醇提取物；白念珠菌；细胞膜；麦角甾醇

Butyl alcohol extract of Baitouweng decoction inhibits

Candida albicans cell membrane

HU Tangling 1，2， YUN Yun1，2， XU Zhiqing 1，2， DUAN Qiangjun 1，2， SHAO Jing 1，2，

WANG Tianming 1，2， WANG Changzhong 1，2*

（1Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Anhui University of

Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China；

2Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Anhui Academy of

Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China）

[Abstract]To study the inhibitory effect of butyl alcohol extract of Baitouweng decoction（BAEB） on Candida albicans cell membrane The effects of BAEB on the activity of C albicans were observed by Spot assay The changes of intracellular osmotic pressure of C albicans after BAEB intervention were detected by microtiter plate reader The effect of BAEB on cell membrane permeability of C albicans were observed by fluorescence microscopy The content of ergosterol in C albicans cell membrane was detected by high performance liquid chromatography， and the expression of ergosterol biosynthesis related genes in cell membrane was detected by qRTPCR The results showed that the activity of C albicans was significantly decreased in 256， 512 and 1 024 mg·L-1 BAEB group The intracellular glycerol content of C albicans was significantly increased in 512 and 1 024 mg·L-1 BAEB group（P<005） The gene HOG1 associated with intracellular osmotic pressure of C albicans was downregulated by 91， 93 and 55 times， respectively C albicans with red fluorescent were increased significantly in 512 and 1 024 mg·L-1 BAEB group The peak area of ergosterol in the 1 024 mg·L-1 BAEB group was 35884 95， with a significant difference（P<005）； ERG1， ERG2， ERG3， ERG4， ERG5， ERG6， ERG10， ERG11， ERG13， ERG24， ERG25， ERG251， ERG26 and UPC2 were downregulated by 658， 489， 415， 924，341， 984， 308， 750， 553， 590， 245， 325，198 and 1007 times respectively in 1 024 mg·L-1 BAEB group The study indicated that BAEB could inhibit ergosterol and its biosynthesis related genes expression in the cell membrane and inhibit the activity of C. albicans.endprint

[Key words]butyl alcohol extract of Baitouweng decoction； Candida albicans； cell membrane； ergosterol

白念珠菌是最常见的条件致病性真菌，常存在于口咽、胃肠道和阴道黏膜表面。正常情况下，白念珠菌一般不会引起人类疾病，但当宿主局部微环境失调或黏膜屏障受损时， 可造成黏膜感染，引起鹅口疮、外阴阴道念珠菌病、间擦疹等疾病[12]，严重者可侵入血管内引起播散性感染[35]。

现有的抗真菌西藥毒副作用大，易耐药[69]。本课题组研究发现中药复方白头翁汤（由白头翁、黄柏、黄连、秦皮组成）正丁醇提取物（butyl alcohol extract of Baitouweng decoction，BAEB）毒性低且具有显著抑制白念珠菌的作用[1012]，但其作用机制不详，本实验以白念珠菌的基本结构细胞膜为切入点，以探讨BAEB对白念珠菌的抑制作用机制。

1材料

11菌株与药物

白念珠菌标准株SC5314由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。白头翁汤按白头翁Pulsatilla chinensis （Bge） Regel 15 g、黄柏Phellodendron chinense Schneid 12 g、黄连Coptis chinensis Franch 6 g、秦皮Fraxini Cortex 12 g组成，购于安徽中医药大学第一附属医院中药房，经安徽中医药大学药学院刘守金教授鉴定。使用80%乙醇70 ℃回流3 h后过滤，收集滤液，共重复回流3次，合并滤液分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取3次，萃取液65 ℃旋转蒸发然后干燥结晶，得到白头翁汤各溶剂提取物经过活性筛选发现正丁醇提取物体外抗白念珠菌的活性最强，故本实验以该提取物为供试药；阳性对照药氟康唑（fluconazole，FLZ）对照品购于中国食品药品检定研究院（批号100314201204）。

12试剂

TotalRNA提取试剂、PCR反应试剂（日本ToyoBo公司）；引物（上海生工生物工程有限公司）；RPMI1640液体培养基（上海玉博生物科技有限公司）；YPD培养基（北京陆桥技术责任有限公司）；沙氏培养基（青岛高科技海博生物技术有限公司）；甘油含量测定试剂盒（南京建成）；蛋白检测试剂盒（碧云天）；PI荧光染料（上海BestBio贝博生物）；皂化剂（15%的氢氧化钠乙醇溶液，本室配制）；麦角甾醇对照品（上海源叶生物科技有限公司）。

13仪器

CKX4132型倒置显微镜（日本Olympus公司）；DMI60000B倒置荧光显微镜（德国徕卡光学仪器公司）；ABI Spectra Max M2e多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；ABI7500荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）；高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1260 Infility）；色谱柱COSMOSIL 5C18MSⅡ柱（46 mm×250 mm，5 μm）。

2方法

21Spot assay检测白念珠菌细胞活性[13]

从4 ℃保存的YPD培养平板上挑取单菌落白念珠菌，接种至液体沙氏培养液，37 ℃摇床中过夜培养，离心收集菌体，血细胞计数板计数，RPMI 1640 培养液稀释至2×106 CFU/mL备用。将菌液稀释成2×105 CFU/mL，再按10倍稀释直至2×101 CFU/mL，取100 μL分别与100 μL终浓度为0，256，512，1 024 mg·L-1的BAEB和终浓度为128 mg·L-1的阳性对照药氟康唑（FLZ）混合，依次取5 μL点种在固体沙氏培养基上。37 ℃培养48 h后取出，观察CFU生成情况并拍照。

22酶标仪检测白念珠菌细胞内渗透压变化[14]

将1 mL（2×106 CFU/mL）菌液分别和1 mL终浓度为0，256，512，1 024 mg·L-1BAEB及终浓度为128 mg·L-1的FLZ混合，37 ℃培养12 h后，按照甘油含量测定试剂盒说明书检测胞内甘油总量，按照蛋白检测试剂盒方法来测定样品蛋白总量。根据甘油总量和蛋白总量来计算甘油含量：甘油含量=甘油总量/蛋白总量。

23荧光显微镜检测白念珠菌细胞膜通透性变化[10]

取1 mL（2×106 CFU/mL）菌液分别与1 mL终浓度为0，256，512，1 024 mg·L-1BAEB和终浓度为128 mg·L-1的FLZ于6孔板中混合，37 ℃，培养12 h后，离心收集细胞，无菌PBS缓冲液洗3遍，重悬细胞浓度为1×106 CFU/mL，用PI荧光染料避光染色5 min，均匀涂抹在含有多聚赖氨酸的载玻片上，用荧光显微镜观察并拍照。

24HPLC检测白念珠菌细胞膜麦角甾醇含量[1516]

取5支10 mL无菌试管，均加入2 mL 2×106 CFU/mL菌液，分别加入2 mL终浓度分别为0，256，512，1 024 mg·L-1BAEB和终浓度为128 mg·L-1的FLZ，37 ℃，200 r·min-1培养12 h，弃上清后，用无菌PBS清洗3次，每管均加入2 mL PBS和5 mL皂化剂混匀，80 ℃水浴皂化1 h，每隔15 min振摇1次，冷却至室温，每管加入5 mL石油醚剧烈振荡3 min，重复萃取3次，合并萃取液，加入蒸馏水洗涤1次，剧烈振荡3 min，取出醚层于60 ℃水浴挥发干即得未皂化酯（NSLs），加入1 mL甲醇充分混匀溶解，过滤后进样10 μL进行HPLC分析。色谱条件：COSMOSIL 5C18MSⅡ色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇；检测波长282 nm；柱温室温；流速1 mL·min-1。对照品配制：022 mg麦角甾醇溶于2 mL甲醇中，超声溶解得110 mg·L-1麦角甾醇对照品溶液。endprint

25qRTPCR检测细胞膜麦角甾醇生物合成相关基因的表达[10]

总RNA的提取：2 mL菌液（2×106 CFU/mL）与2 mL终浓度分别为0，256，512，1 024 mg·L-1BAEB和终浓度为128 mg·L-1的FLZ混合，37 ℃孵育6 h后，离心收集菌体，用无菌PBS冲洗3次后进行总RNA提取，调节RNA浓度，使模板量一致，具体操作方法参照ToyoBo公司MagExtractorRNA提取试剂说明书进行。

26引物的设计与合成

基因序列從NCBI获得，并用Oligo70软件设计所需引物，委托上海生工合成引物，各引物情况见表1。

27逆转录cDNA

6 μL RNA预变性（65 ℃ 5 min，4 ℃ 1 min），后加入混合液（4×DNA Master Mix 55 μL和gDNA Remover 11 μL）2 μL，5RTMaster MixII 2 μL混合后按如下条件进行逆转录：50 ℃ 5 min；98 ℃ 5 min；4 ℃ 1 min反应完成后将 cDNA稀释10倍备用。

28实时荧光定量PCR反应

采用SYBR荧光法，反应体系25 μL：2×SYBRGreen Realtime PCR 125 μL，PCR forward primer（10 mol·L-1）1 μL，PCR reverse primer 1 μL，cDNA 05 μL，ddH2O 10 μL，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应条件： 预变性 95 ℃ 60 s；扩增定量程序（amplification and quantification program）40个循环，循环参数为：变性95 ℃ 15 s；退火50 ℃ 15 s；延伸72 ℃ 45 s；熔解曲线（melting curve）：60～95 ℃，加热速率为01 ℃·s-1，内参基因为ACT1，每个样品均设置3个重复组，实验重复3次。实时荧光定量PCR分别测定目的基因ERG1，ERG2，ERG3，ERG4，ERG5，ERG6，ERG10，ERG11，ERG13，ERG24，ERG25，ERG251，ERG26与UPC2及内参ACT1的Ct值，实验结果取其平均值，基因表达水平用倍数变化来表示（2-ΔΔCt法）。

29统计学处理

所有数据应用SPSS 23统计软件分析处理，计量资料以±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析检验，P<005为有统计学差异。

3结果

31BAEB对白念珠菌细胞活性的影响

空白对照组白念珠菌细胞菌落数（CFU/mL）最多，细胞活性最好；BAEB干预下随着浓度递增，细胞菌落数逐渐减少，细胞活性减弱，见图1。

32BAEB对白念珠菌细胞内渗透压的影响

与空白对照组相比，随着BAEB浓度的递增，白念珠菌胞内甘油含量呈剂量依赖性升高，分别为（33751±05），（44464±09），（57193±43）μmol·g-1，其中512 mg·L-1BAEB组和1 024 mg·L-1BAEB组甘油含量升高，有显著性差异（P<005），见图2。qRTPCR 检测渗透压相关基因HOG1和RHR2的表达，HOG1分别下调为空白对照组的91，93，55倍，有显著性差异（P<001），RHR2下调不明显，见图2。

33BAEB对白念珠菌细胞膜通透性的影响

荧光显微镜下，空白对照组几乎看不到红色荧光细胞，随着BAEB浓度的增加，红色荧光细胞逐渐增多。相对应的明场视野下的菌体形态见图3。

34BAEB对白念珠菌细胞膜麦角甾醇含量的影响

HPLC结果显示：110 mg·L-1麦角甾醇对照品检测出峰时间t为13266 min，峰面积为963091 31。

空白对照组t为13231 min，峰面积为60890 22；256 mg·L-1BAEB组t为13210 min，峰面积为41671 36；512 mg·L-1BAEB组t为13221 min，峰面积为36309 44；1 024 mg·L-1BAEB组t为13207 min，峰面积为35884 95。FLZ组未显示峰，见图4。

35BAEB对白念珠菌细胞膜麦角甾醇生物合成相关基因表达的影响qRTPCR结果显示，1 024 mg·L-1BAEB干预组ERG1，ERG2，ERG3，ERG4，ERG5，ERG6，RG10，ERG11，ERG13，ERG24，ERG25，ERG251，ERG26与UPC2 分别下调658，489，415，924，341，984，308，750，553，590，245，325，198，1007倍；512 mg·L-1BAEB干预后，分别下调644，29，574，1042，348，

846，242，782，464，689，395，519，192，1872倍； 256 mg·L-1组分别下调1258，149，720，1264，412，1019，251，1179，689，1495，105，602，461，6971倍，见图5。

4讨论

抗真菌药物根据作用机制或靶点分为抑制细胞膜麦角甾醇合成的唑类（如氟康唑等），抑制细胞壁β葡聚糖合成的棘白素类（卡泊芬净等）以及抑制DNA合成的氟胞嘧啶等。但随着抗真菌药的广泛应用，白念珠菌耐药情况越来越严重，亟需发掘新的抗真菌药物。本课题组发现中药复方白头翁汤具有较强的抗白念珠菌作用，尤以其正丁醇提取部位（BAEB）的抗菌活性最强，但作用机制不详。受现有抗真菌药物作用靶点启发，BAEB是否通过影响细胞膜等结构而发挥其抗真菌作用成为本研究主要内容。故本实验拟研究BAEB对白念珠菌细胞膜的作用及机制。endprint

从Spot assay来看，BAEB干预组下白念珠菌菌落数（CFU/mL）明显减少，BAEB可显著抑制白念珠菌活性。细胞膜是白念珠菌的基本结构，细胞膜的损伤会导致白念珠菌受到渗透压力的胁迫，而高渗透压力会激活胞内的HOG通路合成更多的甘油以平衡渗透压的改变[17]。1 024 mg·L-1BAEB组白念珠菌细胞内甘油含量最高，有显著性差异（P<005），渗透压最高。此外，在基因水平上，256，512，1 024 mg·L-1的BAEB均使得HOG1明显下调，而RHR2无明显改变。

荧光染料碘化丙啶（PI）是可用于DNA染色的细胞核染色试剂，在嵌入双链DNA后释放20～30倍的红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色，从而间接提示细胞膜的损伤。荧光显微镜观察显示，空白对照组的白念珠菌红色荧光细胞最少，1 024 mg·L-1BAEB组白念珠菌红色荧光细胞最多，说明1 024 mg·L-1BAEB组细胞膜损伤最严重。

麦角甾醇是白念珠菌细胞膜的重要成分，由于其特殊的化学结构，增加了细胞膜的坚固性，并参与其多项重要的生命活动，如保持细胞膜结合酶的活性及细胞活力，参与细胞物质交换，对于维持细胞膜完整性及流动性十分重要，且参与白念珠菌的不对称分裂等生理过程[18]。唑类药物如FLZ能够和羊毛甾醇的14α甾醇脱甲基酶（由ERG11编码）活性位点中的血红素基团相互作用，影响麦角甾醇合成途径中羊毛甾醇的14α脱甲基作用，导致副产物14αmethy13，6diol的积累，改变细胞膜通透性和流动性[19]。HPLC结果显示，空白对照组出峰时间t为13231 min，峰面积为60890 22，1 024 mg·L-1BAEB组t为13207 min，峰面积为35884 95，有显著性差异（P<001）。麦角甾醇生物合成受一系列相关基因调控，qRTPCR显示与白念珠菌麦角甾醇合成相关的基因ERG1，ERG2，ERG3，ERG4，ERG5，ERG6，ERG10，ERG11，ERG13，ERG24，ERG25，ERG251，ERG26与UPC2经1 024 mg·L-1BAEB干预，分别下调658，489，415，924，341，984，308，750，553，590，245，325，198，1007倍，表明一定浓度的BAEB可能通过影响上述麦角甾醇相关基因的表达来抑制麦角甾醇的生物合成进而影响白念珠菌细胞膜的完整性。

综上述研究显示，BAEB能损伤白念珠菌基本结构细胞膜，其抗白念珠菌作用机制可能与其有关，但详细作用机制有待于进一步揭示。

[参考文献]

[1]廖万清. 21世纪真菌病学研究展望[J]. 上海医学， 2000，23（3）： 132.

[2]Ruhnke M， Rickerts V， Cornely O A， et al. Diagnosis and therapy of Candida infections： joint recommendations of the German Speaking Mycological Society and the PaulEhrlichSociety for Chemotherapy[J]. Mycoses， 2011， 54（4）：279.

[3]潘搏. 白念珠菌甘露多糖疫苗評价及白念珠菌侵入人内皮和上皮细胞动态观察[D]. 上海：第二军医大学，2015.

[4]Guo F， Yang Y， Kang Y， et al. Invasive candidiasis in intensive care units in China： a multicentre prospective observational study[J]. Antimicrob Chemother， 2013， 68（7）：1660.

[5]Ma C F， Li F Q， Shi L N， et al. Surveillance study of species distribution， antifungal susceptibility and mortality of nosocomial candidemia in a tertiary care hospital in China[J]. Bmc Infect Dis， 2013， 13（1）：1.

[6]张瑾，高月平. 中药治疗阴道炎研究进展[J]. 实用中医药杂志，2009，25（2）：135.

[7]于晓虹，杨国玲，刘晓明，等. 氟康唑、特比萘芬和伊曲康唑对白色念珠菌的体外敏感性试验[J]. 中国皮肤性病学杂志，2008，22（11） ： 668.

[8]张文平，王小丽，黄真，等. 肉桂醛体外诱导白色念珠菌耐药的实验[J]. 中国临床康复，2006，10（35） ： 148.

[9]陈文峰，张子平，程波. 抗真菌药物的新作用靶点[J]. 中国真菌学杂志，2011，6（3）：190.

[10]张梦翔，陆克乔，夏丹，等. 白头翁汤正丁醇提取物对白念珠菌VVC临床株体外生物膜形成的抑制作用[J]. 中国真菌学杂志，2015，10（6）： 321.

[11]施高翔，汪云霞，冯鑫，等. 白头翁汤正丁醇提取物诱导白念珠菌生物被膜细胞凋亡[J]. 中国真菌学杂志，2017， 12（1）：13.

[12]张梦翔，夏丹，施高翔，等. 白头翁汤正丁醇提取物对碱性pH条件下白念珠菌VVC临床临床株形态转化的影响[J]. 中国中药杂志，2015，40（4）：710.

[13]Sharma M， Manoharlal R， Puri N， et al. Antifungal curcumin induces reactive oxygen species and triggers an early apoptosis but prevents hyphae development by targeting the global repressor TUP1 in Candida albicans[J]. Biosci Rep，2010，30（6）：391.endprint

[14]Brewster J L， De V T， Dwyer N D， et al. An osmosensing signal transduction pathway in yeast[J]. Science， 1993， 259（5102）：1760.

[15]Pinto E， Afonso C， Duarte S， et al. Antifungal activity of xanthones： evaluation of their effect on ergosterol biosynthesis by highperformance liquid chromatography[J]. Chem Biol Drug Des，2011，77（3） ： 212.

[16]Sun S， Gao Y， Ling X， et al. The combination effects of phenolic compounds and fluconazole on the formation of ergosterol in Candida albicans determined by highperformance liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Anal Biochem，2005，336（1） ：39.

[17]Gregori C， Schüller C， Roetzer A， et al. The highosmolarity glycerol response pathway in the human fungal pathogen Candida glabrata strain ATCC 2001 lacks a signaling branch that operates in baker′s yeast[J]. Eukaryot Cell，2007，6（9）：1635.

[18]曹立，谭军艳，许雯倩，等. 白念珠菌生物被膜耐药株麦角甾醇检测的方法研究[J]. 口腔生物医学，2013，4（2）：70.

[19]Ghannoum M A， Rice L B. Antifungal agents： mode of action， mechanisms of resistance， and correlation of these mechanisms with bacterial resistance[J]. Clin Microbiol Rev， 1999，12（4）：501.

[責任编辑张宁宁]endprint