大黄酸PEGPCLPEI纳米粒的制备及体外评价

陳丹飞1， 朱永琴1， 张源1， 王林燕2， 魏颖慧2*

（1 浙江中医药大学 附属第一医院， 浙江 杭州 310006；

2 浙江中医药大学 药学院， 浙江 杭州 310053）

[摘要]合成聚乙二醇聚己内酯聚乙烯亚胺（PEGPCLPEI）三嵌段聚合物载体材料，制备包载大黄酸（RH）的PEGPCLPEI纳米粒（PPPRHNPS），并评价其理化性质和体外生物学特性。通过开环聚合和麦克尔加成反应合成得到PEGPCLPEI聚合物，相对分子质量为95×103，临界胶束浓度为0723 nmol·L-1。包载RH制备得到PPPRHNPS，外观浅黄、乳光明显，透射电镜观察纳米粒分散均匀圆整无团聚，粒径为（1183±36）nm，PDI为（019±008），Zeta电位为（63±15）mV，包封率为（9364±528）%，载药量为（857±053）%。透析法考察PPPRHNPS体外释药特征，48 h内累积释放率为7592%，释药曲线符合Higuchi模型方程：Q=0121 6t1/2+0069 5（R2=0887 4），呈缓释特性。选用兔红细胞考察其溶血率，MTT法评价其对HK2细胞的生物安全性，在0～005 mmol·L-1不会引起红细胞溶血和细胞毒性。流式细胞仪考察其摄取效率，PPPRHNPS可被细胞迅速内吞，摄取效率高，30 min内摄取完全，经激光共聚焦显微镜观察，PPPRHNPS能够从溶酶体进入细胞质，具有溶酶体逃逸特性。因此，该研究成功合成PEGPCLPEI聚合物和制备得到PPPRHNPS，粒径分布均匀，包封率及载药量较高，摄取迅速，具有缓释特征、溶酶体逃逸特性、优良的生物安全性，是一种良好研究前景的新型纳米制剂。

[关键词]大黄酸； 聚乙二醇聚己内酯聚乙烯亚胺； 纳米粒； 体外评价

Preparation and in vitro evaluation of rheinloaded

PEGPCLPEI nanoparticles

CHEN Danfei1， ZHU Yongqin1， ZHANG Yuan1， WANG Linyan2， WEI Yinghui2*

（1. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310006， China；

2College of Pharmaceutical Science， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China）

[Abstract]This study was aimed to synthesize the polyethyleneglycolpolycaprolactonepolyethyleneimine （PEGPCLPEI） three block polymer material， prepareRhein （RH）loaded PEGPCLPEI nanoparticles（PPPRHNPS）， and then evaluate their physical and chemical properties and biological characteristics in vitro PEGPCLPEI polymer was obtained by adopting theringopening polymerization and Michael addition reaction， and their physical and chemical properties were analyzed by using NMR and gel permeation chromatography PEGPCLPEI was then used as the carriers to prepare PPPRHNPS by applying spontaneous emulsification solvent diffusion method The results showed that molecular weight of PEGPCLPEI polymer was 95×103， and critical micelle concentration was 0723 mmol·L-1 PPPRHNPS had pale yellow， opalescence faade， round and smooth without aggregation， formed of （1183（36） nm in particle size with PDI of （019±008）， Zeta potential of （63±15） mV， entrapment efficiency of （9364±528）%， and drug loading of （857±053）% The accumulative release percentage of PPPRHNPS was 7592% in 48h， and the release profiles in PBS conformed to the Higuchi equation： Q=0121 6t1/2+0069 5 （R2=0887 4）， presenting slow release characteristics Within the scope of the 0005 mmol·L-1， the nanoparticles had no obvious hemolysis on rabbit red blood cells and toxicity on HK2 cells In the investigation of uptake efficiency by flow cytometry， nanoparticles can be absorbed into cells quickly and internalized within 30 minutes fully， with a high uptake efficiency In confocal laser scanning microscope observation， the nanoparticles can escape from lysosome into cytoplasm Herein， this study synthesized the PEGPCLPEI polymer and prepared PPPRHNPS successfully； the nanoparticles showed uniform particle size， higher encapsulation efficiency and drugloading rate， slow release characteristics， quick uptake and internalization， lysosome escape property and good biocompatibility PPPRHNPS will be a promising pharmaceutical formulation for further developmentendprint

[Key words]rhein； PEGPCLPEI； nanoparticles； property evaluation

大黄酸（rhein，RH）为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L、唐古特大黄R tanguticum Maxim ex Balf等传统中药分离提取的有效成分，属于单蒽核类1，8二羟基蒽醌衍生物，药理研究证实，RH可显著抑制肾小球系膜细胞的增生、肥大以及细胞外基质的产生[1]，同时RH能抑制人肾小管上皮细胞TSP1，TGFβ1的mRNA转录和蛋白表达，保护肾脏固有功能[23]，在对肾脏疾病的干预中发挥着多靶点多层次的治疗作用。但是，RH溶解性差、半衰期短、肾脏富集率低、生物利用度低[4]、且具有一定的肝毒性，限制了其临床应用。有研究者采用新型纳米粒作为药物载体，包载RH后进行递药输送，能够提高RH的水溶性、延长半衰期和赋予缓控释的特点[5]。但是普通纳米粒经细胞摄取后会直接进入溶酶体，溶酶体作为细胞的“垃圾处理站”，其富含大量各类酸性水解酶，对进入其中的各类物质进行消化和分解，从而使药物丧失活性，极大降低了纳米递药系统的疗效[67]。因此，研究包载RH且具备溶酶体逃逸功能的纳米粒对提高RH的药效和促进RH的临床转化具有重要意义。

聚乙烯亚胺（PEI）是一类广泛应用于核酸递药的阳离子聚合物，其分子结构由大量的各级胺构成，在生理条件下分子中仅有15%～20%的胺质子化，对生理环境的不同pH有很强的缓冲能力，可以有效提高递药体系的稳定性；当被细胞摄取进入溶酶体后，由于溶酶体内pH较低，分子中大于70%的胺被质子化，能够大量捕获质子，引起氯离子内流进入溶酶体，溶酶体内的渗透压不断升高，最终使溶酶体破裂从而将内吞的载体和药物释放到细胞质，而后发挥药理作用[89]。因此，在前期实验的基础上，本研究拟通过迈克尔加成反应，将PEI化学偶联至聚乙二醇聚己内酯上，合成三嵌段聚合物聚乙二醇聚己内酯聚乙烯亚胺（PEGPCLPEI），合成具备溶酶体逃逸功能的聚合物。以PEGPCLPEI为药物载体，以包封率、载药量和粒径为主要指标，制备包载RH的PEGPCLPEI纳米粒（PPPRHNPS），并进行药剂学特性评价；透析法考察其体外释药特性、MTT法评价其对HK2细胞的生物安全性、流式细胞仪考察其摄取效率、共聚焦显微镜考察其溶酶体逃逸特性，为PPPRHNPS体内药效学研究奠定基础，并为RH及同类药物的新型纳米制剂的研究提供参考。

1材料

RH原料药（南京泽朗医药科技有限公司，纯度≥98%，批号201307）；RH对照品（中国食品药品检定研究院，批号110757200206）；聚乙二醇单甲醚（PEG，相对分子质量2×103）、己内酯、辛酸亚锡、丙烯酰氯、BOC丙氨酸、13′二甲氨基丙基3乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N羟基琥珀酰亚胺（NHS）（安耐吉化学萨恩化学技术有限公司）；聚乙烯亚胺（PEI，相对分子质量18×103）、噻唑蓝（MTT）（上海阿拉丁试剂有限公司）；泊洛沙姆188（德国巴斯夫公司）；Cy5N羟基琥珀酰亚胺酯（Cy5NHS）（杭州墨丘利生物医药科技有限公司）；甲醇（美国Honeywell公司）；磷酸（美国TEDIA公司）； DMEM培养基（添加有45 g·L-1葡萄糖、37 g·L-1碳酸氢钠、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺、100 mg·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素）、025%胰蛋白酶溶液（美国Gibco公司）；细胞核染料Hoechst 33342、溶酶体绿色染料LysoTracker Green DND99（美国Thermo Fisher Scientific公司）；N，N二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷、三乙胺等均为国产分析纯。

Bruker Avance400型核磁共振仪（德国Bruker公司）；NanoZS 90激光粒度分析仪（英国Malvern公司）；Agilentl200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）； JEM1200EX透射电镜（日本电子株式会社）； Waters1515型凝胶色谱仪（美国Waters公司）；SpectraMaxM5多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；ST16R台式离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；MillQ超纯水仪（美国Millpore公司）； Thermo Scientific Forma Ⅱ CO2培养箱（美国Thermo公司）；MD200氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）；DZF6020真空干燥箱（广州康恒仪器有限公司）；CP225D电子天平（北京賽多利斯仪器有限公司）；等。

兔红细胞（浙江中医药大学实验动物中心提供）；HK2细胞（源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）。

2方法

21载体材料的合成与表征

211PEGPCL和PEGPCLPEI的合成聚乙二醇单甲醚（PEG）和已内酯严格除水后使用，取50 mL圆底烧瓶加热抽真空干燥后，在氮气保护下依次加入PEG（2 g，1 mmol）、己内酯（10 mL，90 mmol）、辛酸亚锡（082 g，2 mmol），于110 ℃搅拌反应24 h，冷却后将混合物溶解在少量二氯甲烷中，用冰乙醚沉淀3次，最后砂芯漏斗过滤，固体抽真空干燥得到PEGPCL约6 g，产率约75%。

取PEGPCL（2 g，025 mmol）溶解于无水的二氯甲烷20 mL中，加入无水的三乙胺1 mL，氮气保护，缓慢滴加丙烯酰氯80 μL，室温搅拌反应6 h后，饱和食盐水萃取3次，每次20 mL，有机相旋蒸浓缩后，用冰乙醚沉淀，砂芯漏斗过滤，固体抽真空干燥得到PEGPCLCOCHCH2约12 g，产率约60%。

取PEGPCLCOCHCH2（1 g，0125 mmol）和PEI（036 g，02 mmol）溶解于10 mL DMF中，加入1 mL吡啶，60 ℃搅拌反应12 h，将反应液倒入截留相对分子质量为10×103透析袋，首先于DMF中透析24 h，后转移到纯水中透析24 h，最后经冷冻干燥得到淡黄色固体PEGPCLPEI约08 g，产率约65%。endprint

通过核磁共振仪测定所得产物的核磁共振氢谱（1HNMR），采用凝胶色谱仪测定所得聚合物的相对分子质量及相对分子质量分布曲线。采用荧光法测定PEGPCL和PEGPCLPEI的临界胶束浓度（CMC）：以芘为荧光探针，溶于丙酮配制20 mg·L-1母液，取离心管，每管加入100 μL母液，自然挥干丙酮后，加入1 mL一系列浓度的聚合物混悬液，最终芘质量浓度为2 mg·L-1，室温置于摇床中摇动过夜，酶标仪测定聚合物混悬液中芘的荧光光谱，固定最大发射波长为390 nm，扫描芘在300～360 nm激发光谱图，计算各浓度下激发光谱图338，333 nm荧光强度的比值（I338/I333），绘制聚合物浓度与I338/I333曲线，计算曲线拐点处浓度为聚合物CMC。

212荧光标记的PEGPCL和PEGPCLPEI的合成取PEGPCL（1 g，0125 mmol）、BOC丙氨酸（189 mg，1 mmol）、EDC（48 mg，025 mmol）和NHS（30 mg，025 mmol）溶于10 mL二氯甲烷中，室温搅拌反应12 h，冰乙醚沉淀后，固体溶于20 mL二氯甲烷中，加入2 mL三氟乙酸搅拌1 h，饱和食盐水萃取3次，每次20 mL，有机相旋蒸浓缩后，用冰乙醚沉淀，固体抽真空干燥，得到氨基修饰的PEGPCLCOCH2CH2NH2（PEGPCLNH2）约045 g，产率约41%。

分别取PEGPCLNH2和PEGPCLPEI各200 mg，分别溶于5 mL的DMF中，各加入Cy5NHS 1 mg和075 mg（按照理论摩尔接枝率5%投料），避光45 ℃搅拌反应24 h，将反应液倒入截留相对分子质量为35×103透析袋中，首先于DMF透析12 h，后转移到纯水中透析24 h，最后经冷冻干燥得到蓝色固体粉末即Cy5标记的PEGPCL（PEGPCLCy5）和Cy5标记的PEGPCLPEI（PEGPCLPEICy5）。使用低相对分子质量35×103透析膜进行透析纯化，聚合物基本没有损失。经酶标仪扫描荧光波谱强度，按摩尔比计算，PEGPCLCy5和PEGPCLPEICy5荧光接枝率分别约为32%和39%。

22药物测定方法的建立

精密配制浓度为010 g·L-1的RH对照品母液，稀释至质量浓度为01，05，1，5，10，20，40，80 mg·L-1系列溶液，采用HPLC进行测定。色谱柱Platisil ODS型（46 mm×150 mm，5 μm），流动相甲醇01%磷酸（75∶25），流速10 mL·min-1；柱温25 ℃，检测波长254 nm，以峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标拟合标准曲线。取1，10，40 mg·L-1的3种浓度RH溶液，分别在日内测定5次并且连续测定3 d，计算RH的日内、日间精密度。按处方量的80%，100%，120%精密称取RH，分别加入处方比例的辅料，搅拌混合，用甲醇溶解定容后，经022 μm微孔滤膜过滤后测定药物浓度，计算RH回收率。

23纳米粒的制备和表征

采用乳化溶剂挥发法制备PPPRHNPS：称取适量RH和20 mg PEGPCLPEI溶于2 mL体积比为2∶1的丙酮甲醇的混合溶剂中，构成有机相；另取10 mL质量分数为1%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物（泊洛沙姆188）水溶液作为水相；800 r·min-1搅拌下将有机相以缓慢滴加到水相中，滴毕，继续搅拌30 min，减压蒸出有机溶剂和部分水，调整体积至10 mL，即得到具有黄色乳光的PPPRHNPS混悬液。同法制备载RH的PEGPCL纳米粒（PPRHNPS）、荧光标记的纳米粒PPPCy5RHNPS和PPCy5RHNPS，以及未载药的空白纳米粒PPPNPS和PPNPS。

取少量PPPRHNPS混悬液，蒸馏水稀释后经粒径仪测定其平均粒径及Zeta电位。取一滴PPPRHNPS混悬液滴于铜网上，放于烤灯下蒸干溶剂，经20%磷钨酸溶液负染，置于透射电子显微镜观察其微观形貌特征。精密量取1 mL PPPRHNPS混悬液置于离心管中，于2×104 r·min-1离心30 min，取上清液经HPLC测定游离的RH浓度，计算包封率和载药量。

24体外释药特性考察

选择含2%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）的pH 74 PBS缓冲液作为释放介质，采用透析法考察PPPRHNPS体外释药特性：分别取PPPRHNPS混悬液、PPRHNPS混悬液和RH溶液（RHsol）适量（折合RH质量为05 mg）加入透析袋内，用透析夹封口后置于200 mL释放介质中，放于37 ℃恒温水浴振荡（60 r·min-1）中恒温振荡，分别于025，05，1，2，3，4，6，8，12，24，48 h取释放介质1 mL，补加等量空白释放介质，试样处理后经HPLC测定RH含量，计算累积释放百分率（Q），绘制并拟合体外释药曲线。

25体外溶血实验

取抗凝后的新鲜兔血，加入离心管，于2 000 r·min-1离心5 min去除上层血清和蛋白后，用pH 74的PBS缓冲液重悬冲洗并离心3次，直至上清液不显红色，最后PBS缓冲液稀释配制浓度约为1×108个/mL红细胞储备液。在离心管中加入一定质量浓度的PPPNPS混悬液和PPNPS混悬液，PBS缓冲液稀释至系列梯度浓度，使得总体积为900 μL，最后加入100 μL的红细胞储备液。将离心管置于37 ℃恒温摇床中振荡，2 h后，于2 000 r·min-1离心5 min分离出未破裂的红细胞。收集上层液200 μL，使用酶标仪测定其在540 nm处的吸光度（A）。以相应PBS溶液作为阴性对照，纯水溶液作为阳性对照，计算溶血率（hemolysis ratio），溶血率=（A样-A阴）/（A阳-A阴） ×100%。

26细胞毒性实验

取对数生长期HK2细胞，025%胰蛋白酶消化、收集、离心后，用DMEM培養基稀释细胞至密度为5×104个/mL，取96孔板，每孔加入180 μL，稳定12 h后，实验组分别加入系列梯度浓度的纳米制剂混悬液20 μL，对照组加入等量的PBS，各组平行6孔。48 h后每孔加入20 μL的 5 g·L-1 MTT溶液，继续孵育4 h，离心弃上清后加入200 μL 二甲亚砜，置于振荡器上振荡1 min，以570 nm为检测波长和以620 nm为校正波长，用酶标仪测定的吸光度（A），计算细胞存活率（cell viability），细胞存活率=A实验组/ A对照组×100%。endprint

27细胞摄取效率考察

将对数生长期的HK2细胞用DMEM培养基稀释至密度为1×105个/mL的细胞悬液，取12孔板，每孔加入1 mL细胞悬液，稳定培养12 h。于一定的时间点加入100 μL等量荧光强度的PPPCy5RHNPS或PPCy5RHNPS，使其孵育0，025，05，1，15，2，3 h，吸弃培养基，PBS冲洗3遍，胰酶消化，收集细胞，采用流式细胞仪测定HK2细胞在不同孵育时间摄取各纳米制剂的平均荧光强度，绘制摄取速率曲线，评价HK2对各纳米制剂的摄取效率。

28细胞摄取机制考察

将对数生长期的HK2细胞用DMEM培养基稀释至密度为1×105个/mL的细胞悬液，取规格为35 mm的玻底培养皿，每皿加入1 mL细胞悬液，稳定培养24 h。采用激光共聚焦显微镜观察PPPCy5RHNPS和PPCy5RHNPS的细胞摄取过程及胞内分布：首先按照Hoechst 33342试剂盒和LysoTracker Green DND99试剂盒操作指南，每皿加入02 μL LysoTracker Green DND99标准液，20 min后每皿滴加2滴Hoechst 33342标准液，孵育30 min后，吸取培养基，PBS冲洗一遍，加入新鲜DMEM培养基，然后加入100 μL PPPCy5RHNPS或110 μL PPCy5RHNPS混悬液，分别于孵育15 min，1 h和3 h观察，激光共聚焦显微镜分别选取DAPI通道、488 nm通道和640 nm通道3个光源通道，考察各纳米制剂的细胞摄取过程及胞内分布情况。

3结果

31载体材料的表征

聚合物PEGPCLPEI的合成路线见图1A，图1B为PEGPCL的1HNMR（CDCl3，400 Hz）δ：138[10077H，COCH2CH2CH2CH2CH2O]，163[20045H，COCH2CH2CH2CH2CH2O]，229[9989H，OCOCH2]，338（3H，CH3O），365[18055H，CH2CH2O]，406[9823H，CH2OCO]，通过聚乙二醇上单甲氧基的3个氢为基准，推算出合成的PEGPCL的相对分子质量约为77×103（2 000+100/2×114 =7 700）。图1C为PEGPCLCOCHCH2的的1HNMR图谱，峰位和大小与B图一致，多出的1组峰为反应结合丙烯酰的3个氢，55～65（359H，OCOCHCH2），积分氢数量大于理论值，表明产物中有少量未除尽的丙烯酰，并不影响下一步反应。图1D为PEI的核磁图谱，其相对分子质量为18×103，积分约为170个氢，256[170H，CH2CH2NH]。图1E为最终合成得到的PEGPCLPEI，1HNMR（CD3OD，400 Hz）：由于单甲氧基与甲醇的溶剂峰重合，因而采用聚乙二醇主链上的180个氢作为基准进行校正计算，129[10041H，COCH2CH2CH2CH2CH2O]，153[19987H，COCH2CH2CH2CH2CH2O]，227[9854H，OCOCH2]，355[180H，CH2CH2O]，396[9939H，CH2OCO]，250[195H，CH2CH2NH]，相对分子质量约为98×103（7 700+195/4×43=9 796），通过PEI峰位氢的实际值和理论值对比计算，合成得到的PEGPCLPEI纯度约为90%，能够符合载体材料的纯度要求。

各聚合物的相对分子质量及相对分子质量分布曲线见图2A，PEGPCLPEI相对分子质量分布均一，PDI为108，而PEGPCL和PEI相对分子质量分布曲线范围更宽，主要由于纯化PEGPCLPEI采用相对分子质量高达10×103透析袋進行透析，能够除掉小相对分子质量的聚合物，使相对分子质量分布曲线范围更窄。通过仪器自带聚乙烯做内参的相对分子质量曲线方程，计算得到重均相对分子质量约为95×103，与核磁估算的结果基本一致。选用荧光探针Cy5对PEGPCL和PEGPCLPEI进行荧光标记，经酶标仪扫描荧光波谱强度，按摩尔比计算，PEGPCLCy5和PEGPCLPEICy5荧光接枝率分别约为32%，39%。

采用荧光法测定聚合物的CMC，以338，333 nm荧光强度的比值（I338/I333）与聚合物浓度拟合曲线，曲线拐点处浓度为聚合物CMC[10]。随着PEGPCL

或PEGPCLPEI聚合物浓度的逐渐增大，芘的激发光强度迅速增大，最大激发波长逐渐由333 nm红移至338 nm，PEGPCL在浓度为02 nmol·L-1附近开始出现荧光强度的突变，PEGPCLPEI在浓度为1 nmol·L-1附近出现明显的荧光强度的突变，见图3。通过对I338/I333与聚合物浓度拟合曲线，计算拐点处的浓度，PEGPCL和PEGPCLPEI的CMC分别为0303，0723 nmol·L-1。PEGPCLPEI的CMC大于PEGPCL的原因主要由于其分子中引入的嵌段PEI为亲水性结构，与疏水嵌段PCL偶联后在一定程度上会阻碍疏水内核结构的形成，随着浓度的增加，疏水嵌段PCL的强大疏水作用最终占据主导，促成自组装形成胶束结构。

32药物测定

经HPLC测定，以峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标拟合标准曲线，RH在05～40 mg·L-1呈良好的线性关系，回归方程A=71272C-12817，R2=0999 8。低中高浓度RH溶液的日内和日间精密度RSD分别为054%，047%，058%和105%，086%，072%，均小于2%。按处方量的80%，100%，120%加入RH后，回收率分别为（9663±238）%，（9701±075）%，（9727±156）%，均符合方法学要求。

33纳米粒制剂的表征

制备得到的PPPRHNPS混悬液呈浅黄色、乳光明显，经荧光探针Cy5标记后PPPCy5RHNPS呈现一定的淡蓝色，测得平均粒径为（1183±36）nm，PDI为（019±008），Zeta电位为（63±15）mV，见图4。用透射电镜观察，PPPRHNPS呈圆球颗粒，大小均匀，分布良好，粒子之间未见明显粘连及团聚现象。制备得到的其他纳米粒制剂粒径均分布在100 nm左右，PDI在01～03，见表1。以PEGPCL为载体所制备的纳米粒均带负电，而以PEGPCLPEI为载体所制备得到的纳米粒均带正电，这主要由于嵌段PEI中各级胺的质子化赋予了纳米粒正电特性。采用高速离心法考察各纳米制剂的包封率和载药量，经HPLC测定，PPRHNPS和PPPRHNPS包封率分别为（4736±381）%和（9364±528）%，载药量分别为（231±038）%和（857±053）%，PEGPCL中引入嵌段PEI后能够显著提高RH的包封率和载药量。endprint

34体外释药考察

RH原药、PPRHNPS和PPPRHNPS的释药曲线见图5，RH原药在释放介质中释药很快，4 h内时药物累计释放率接近90%。PPRHNPS释药行为可以分为突释和缓释两相，开始时释放较快，3 h时药物的累积释放率为5514%，随后释药曲线渐趋平稳，缓慢释药，于48 h时累积释放率为9127%。PPPRHNPS释药曲线更加平稳，具有明显的缓控释特性，3 h内药物的累积释放率为3126%，没有显著的突释现象，于48 h内累积释放率为7592%。PPRHNPS中RH主要以疏水作用的物理包埋方式载入纳米粒中，载药不稳定，释放较快；而PPPRHNPS中除了物理包埋方式，RH中的羧酸根以及酚羟基与嵌段PEI的多级胺能够酸碱离子结合，主要以离子对的形式包载，载药更加稳定，释药平稳而缓慢。

采用经典的零级动力学模型、一级动力学模型、Higuchi模型对PPPRHNPS体外释药特性进行方程拟合，见表2，PPPRHNPS在PBS缓冲液中的释药行符合Higuchi模型方程，为Q=0121 6t1/2+0069 5（R2=0887 4）。

35细胞溶血和细胞毒性考察

采用兔红细胞考察PPNPS和PPPNPS细胞溶血现象，见图6A，随着聚合物浓度的增加，PPNPS

和PPPNPS均出现溶血现象，在低于005 mmol·L-1时红细胞溶血率小于5%，具有良好的溶血耐受性。采用MTT法测定了PPNPS和PPPNPS对HK2的细胞毒性，见图6，孵育48 h后，在聚合物浓度达到01 mmol·L-1时，HK2细胞的存活率仍然保持在90%以上，具备良好的生物安全性。此外，在相同浓度下，PPPNPS比PPNPS具有更高的溶血率和细胞毒性，主要因为PEGPCLPEI聚合物中的嵌段PEI具有较强的正电特性，其结构中多级胺所生成的铵盐能够引起红细胞溶血和细胞毒性，这一问题也是阳离子聚合物及阳离子脂质体等新型纳米制剂普遍存在的弊端[11]。由于PPPNPS包载RH具有较高的包封率和载药量，能够以较低的浓度满足给药剂量，在0～005 mmol·L-1，不会引起红细胞溶血和细胞毒性，仍具备良好的生物相容性。

36细胞摄取效率考察

纳米制剂在不同时间点的摄取情况见图7，各纳米粒制剂随着孵育时间的延长不断被摄取进入细胞中，荧光强度及计数阳性率不断增加。PPCy5RHNPS摄取较缓慢，在90 min时能够达到被完全摄取，而PPPCy5RHNPS摄取十分迅速，15 min内约有60%的纳米粒制剂被摄取进入细胞，30 min基本达到完全摄取，具有较高的摄取效率。由于细胞膜表

37细胞摄取机制考察

激光共聚焦显微镜观察PPCy5RHNPS和PPPCy5RHNPS摄取入胞过程，见图8，PPCy5RHNPS摄取入胞较为缓慢，15 min只有极少的纳米粒摄取进入细胞（红色部分），1 h时大部分进入细胞，但是摄取入胞的纳米粒处置进入溶酶体，3 h时纳米粒仍然完全分布在溶酶体内（绿色和红色完全重合，显黄色），如果药物无法从溶酶体中尽快逃逸释放进入细胞质中，可能会被逐渐分解变质而丧失活性。PPPCy5RHNPS细胞摄取较为迅速，15 min时大量粘附于细胞膜表面周围（红色圆环）并摄取入胞，1 h内完全摄取并分布于溶酶體中，3 h时可见有大量纳米粒逃逸出溶酶体扩散进入细胞质（红色分布整个细胞并只有少量与绿色重合），从而使药物发挥疗效。此种溶酶体逃逸特性正是由于PPPCy5RHNPS中嵌段PEI具有大量荷正电的氨基，在质子海绵效应作用下，溶胀破裂溶酶体，使PPPCy5RHNPS逃逸出溶酶体，最后释放药物。

4讨论

纳米粒作为新型药物载体，能够包载RH等难溶性药物进行递药输送，可以提高难溶性药物的水溶性、延长半衰期和赋予缓控释的特点，从而提高药物疗效。大部分嵌段聚合物制备得到的纳米粒主要通过相似相溶原理依赖其疏水性内核区来包载药物，少量吸附于纳米粒的表面和壳层内，往往难以达到理想的包封率和载药量[1213]。虽然有研究报道采用介孔结构的无机纳米粒能够具备极高的包封率和载药量，但是受限于体内难降解和生物相容性差而无法实现临床转化[14]。目前有较多研究者采用共价偶联制备前药纳米粒、超分子组装体和聚集体、金属络合物以及酸碱离子对等方法提高纳米粒的包封率和载药量，本研究合成制备的三嵌段聚合物PEGPCLPEI中嵌段PEI具有大量的多级胺，在生理环境中显碱性，带正电，RH具有羧酸基团和酚羟基团，显酸性，带负电，两者可以形成酸碱离子对，从而包载RH具有较高的包封率和载药量。

统计研究发现，采用纳米递药系统在治疗各类疾病的研究中，往往难以达到预期治疗效果，主要由于纳米递药体系发挥疗效依赖于最终输送至靶点的有效药量[1516]。大多数载药纳米粒经过血液循环、体内分布、进入组织器官，经细胞摄取吞噬后会直接进入溶酶体，而溶酶体不是药物的作用靶点，其作为细胞的“垃圾处理站”，富含大量酸性水解酶，能对进入其中的各类外源性物质和内源性废物进行消化和分解，如果载药纳米粒不能够及时从溶酶体逃逸进入细胞质，药物就可能失去活性，极大降低纳米递药系统的疗效。PEI在基因递药系统中被广泛用于溶胀溶酶体，促进核酸药物的溶酶体逃逸[89]，其分子结构由大量的各级胺构成，由于溶酶体内pH较低，分子中的胺被质子化，引起氯离子内流进入溶酶体，溶酶体内的渗透压不断升高，使溶酶体破裂从而将内吞的载体纳米粒释放到细胞质，接触作用靶点。本研究运用PEI的特性，偶联嵌段PEI至聚乙二醇聚己内酯聚合物上，不仅能够促进载RH的纳米粒从溶酶体逃逸，而且能够赋予纳米粒正电的特性，大大提高了纳米粒的摄取效率。

本研究成功合成了三嵌段聚合物PEGPCLPEI，制备了包载大黄酸的PEGPCLPEI纳米粒，该纳米粒包封率和载药量较高，粒径分布均匀，体外释药具有缓释特性，表面荷正电，细胞摄取迅速，具备溶酶体逃逸的特性，具有良好的生物安全性。本研究为纳米粒体内药效学考察奠定基础，为RH及同类药物新型纳米制剂的研究提供参考。endprint

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[责任编辑孔晶晶]endprint