朝医八物君子汤拮抗房颤及对Cx40、Cx43表达的影响

金玉　张默函　洪兰++崔昊震

【摘要】本文通过观察朝医八物君子汤拮抗房颤及对心房肌缝隙连接蛋白Cx40、Cx43蛋白表达的影响得出结论，朝医八物君子汤具有拮抗乌头碱诱发房颤的作用，其机制主要与提高Cx40、Cx43蛋白表达水平有关。

【关键词】朝医八物君子汤；房颤；Cx40；Cx43

【中图分类号】R285.5 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2017.03..02

朝医八物君子汤是来源于《东医寿世保元》中的少阴人方剂，其主要组成由人参、黄芪[1]、白术、白芍、当归、川芎、陈皮，甘草等8味药物构成，具有补脾和脾，补气和血之功效，临床上常可用于治疗少阴人惊悸、怔忡等疾病。本研究通过采用急性房颤模型，观察和探讨八物君子汤对房颤大鼠心房肌CX40和CX43蛋白表达、心房肌细胞微结构变化及对ANP分泌的影响，旨在阐明八物君子汤拮抗房颤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

实验动物均采用雄性SD大鼠（体重为200±20 g）。由延边大学实验动物科提供，合格证号：SCXK（吉）2011-0007。八物君子汤的8味药材均购自延吉市中医医院。乌头碱（美国Sigma公司）CX40和CX43多克隆抗体（美国Abcam公司）、辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗（北京中山生物技术公司）；ANP检测试剂盒为北京北方生物技术研究所产品（批准号S10950156）。

1.2 制备八物君子汤提取物

取人参100 g、黄芪、白术、白芍、当归、川芎、陈皮、甘草各50 g切碎，分2次煎煮，每次加入10倍量的水，煎煮2 h，将2次滤液混匀，用旋转蒸发仪进行浓缩。冻干后，最终获得黄褐色粉末状药物，并储存于-20℃冰箱内备用。

1.3 急性房颤模型的制备

用20%乌拉坦将雄性SD大鼠麻醉，快速开胸摘取心脏，并剥离左心房，将其固定在Choi等研制的離体搏动心房灌流装置中。同时给予1.5 Hz的电刺激（电刺激时间为0.3 ms；电压为30 V）来维持体外左心房搏动，用氧饱和的HEPES缓冲液[pH 7.4；（mmol·L-1）：NaC1 118，KC1 4.7，CaC12 2.5，MgC1 1.2，NaHCO3 25，葡萄糖10，HEPES 10，牛血清白蛋白 0.1%]对左心房组织进行持续性灌流，灌流约60 min心房搏动可达到稳定状态。急性房颤模型是在心房灌流模型建立后，先经过1个正常对照循环（12 min）灌流后，继以乌头碱（6×10-7 mol/L）诱发房颤的方法制备急性房颤模型，房颤以BL-420S生理记录仪上显示出现异常心跳波作为急性房颤模型成功的标志。

1.4 动物分组及药物干预

选择10只SD大鼠作为正常对照组，用氧饱和的HEPES缓冲液进行5个循环（60 min）的持续灌流。其余30只随机分为AI模型组（6×10-7 mol/L）和AI+BJD高剂量组（1×10-3 g/mL）及AI+BJD低剂量组（3×10-4 g/mL），每组各10只。AI模型组在进行1个循环（12 min）正常灌流后，进行4个循环（48 min）的乌头碱药物灌流；AI+BJD高低剂量组在进行1个正常循环（12 min）和2个循环（60 min）BJD预处理后，在BJD持续灌流的状态下给予2个循环（24 min）的乌头碱进行灌流。

1.5 乌头碱诱发房颤发生所需时间检测

各组大鼠在急性房颤模型和药物干预过程中，测定乌头碱诱发房颤发生所需的时间变化的平均值。

1.6 心房灌流液中ANP分泌量变化检测

各组大鼠在急性房颤模型和药物干预过程中，测定第1（12 min）、第3（36 min）、第5（60 min）循环结束前4 min的ANP分泌水平变化的平均值。

1.7 心房组织内CX40、CX43蛋白表达检测

采用Western-blot法检测在急性房颤和药物干预过程中心房组织内CX40、CX43蛋白水平变化。灌流实验结束后迅速取出心房组织，称重后将根据组织蛋白提取试剂盒要求提取总蛋白，并测定蛋白样品的浓度。制备10% SDS-PAGE凝胶，电泳分离后用半干转移法将分离胶内的蛋白转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉TBS-T缓冲液封闭PVDF膜上的非特异性位点，并分别加入1∶200稀释的兔抗大鼠CX40、CX43多克隆一抗（美国Abcam公司），在4℃孵育过夜，洗涤后续加入1∶3000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，在室温下孵育1h后洗膜。采用图像分析系统曝光成像并分析图像，以-actin为内参，计算CX40、CX43蛋白的相对表达含量。

1.8 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理，计量资料均以“x±s”表示，采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乌头碱诱发房颤及药物干预后房颤发生所需时间变化的影响

各组大鼠在建立急性房颤模型和药物干预过程中测定房颤发生所需时间变化，发现BJD高、低剂量组均比AI模型组乌头碱诱发房颤所需的时间明显延长（P<0.05）。BJD高剂量组结果中有4只大鼠没有出现乌头碱诱发房颤，即完全抑制了乌头碱作用，而低剂量组则未出现完全抑制的结果，高低剂量组之间相比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 八物君子汤拮抗乌头碱诱发房颤时对ANP分泌的影响

乌头碱诱发房颤时心房明显增加ANP分泌量（P<0.05）；BJD预处理时均出现ANP分泌量上调的趋势，尤其是高剂量组结果显示具有明显增加心房组织ANP分泌的作用（P<0.05）；BJD高低剂量组预处理后，用乌头碱诱发房颤，发现心房组织ANP分泌量明显减弱，差异有统计学意义（P<0.05）。此外，BJD高剂量组对心房组织ANP分泌的抑制作用显著高于低剂量组（P<0.05）。

2.3 各组心房组织中对CX40、CX43蛋白水平变化的影响

3 讨 论

心脏即是泵血器官，又具有内分泌功能。ANP是心房组织分泌的，具有调节体内水钠平衡和血液动力学及改善心肌重构等重要作用的肽类物质。研究表明，房颤上调心房组织对ANP分泌量，其机制可能与房颤时心房压力持续增高，交感神经兴奋性增强，激活血管紧张素Ⅱ受体，介导心房肌细胞产生增生和间质纤维化，进而造成心房体积变大，心房肌细胞结构重塑等病理过程有关[2，3]。本实验中发现八物君子汤可有效降低因乌头碱诱发房颤导致的心房组织对ANP分泌量，且呈浓度依赖性。本研究结果提示八物君子汤能有效改善房颤导致的心房组织损伤，故出现ANP分泌显著减弱的状况。

综上所述，朝医方八物君子汤具有拮抗乌头碱诱导的急性房颤的作用，其作用机制可能与抑制心房组织CX40、CX43蛋白表达水平密切相关。另外，八物君子汤成分比较复杂，其具体的药效成分及作用机制还有待于进一步深入研究。

参考文献

[1] 李 杰，李俊锋，魏婷婷.黄芪苷Ⅳ对心律不齐大鼠的作用及其相关机制[J].广东医学，2016，37（14）：2076-2079.

本文编辑：刘欣悦endprint