转基因植物的筛选与鉴定

王迪

摘 要：随着植物转基因技术的不断进步，它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导，利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T1代种子。文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。

关键词：拟南芥；转基因植物；筛选

中图分类号：Q943 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2017）24-0087-02

1 文献综述

1.1 转基因植物的研究进展

植物的遗传转化是指利用重组DNA，细胞组织培养等方法，将外源基因导入到植物的组织或细胞中，获得转基因植物的技术[1]。从转基因植株成功之后，转基因技术飞速发展，如今，植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。这种技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。

1.2 基因转化技术

随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索，现已发现多种基因转化的方法，例如农杆菌介导的基因转化、花粉管通道法等。相比较其他植物基因的转化方法，农杆菌介导法有着减少成本、容易操作等优点，但对宿主细胞有着严格的要求。每种方法都有其优缺点，所以根据植物的不同种类，我们要选择合理的转化方法，达到理想的转化效果。

1.3 本论文的目的和意义

植物的转基因技术日新月异迅速发展，已经成为许多国家重点发展的新目标新领域，它所产生的巨大的社会和经济效益促使各个国家对其进行更加深入的研究，由其产生的巨大的生产潜能一定会推动社会的进步，改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。

本文以拟南芥为主要研究对象，通过转化后的农杆菌侵染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了转基因植物的筛选。借由本次实验研究，可深入了解基因工程等相关领域的理论，可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技术、植物组织培养技术等等。

2 转基因植物的筛选与鉴定

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

拟南芥

2.1.2 载体与菌株

重组表达载体PMDC150-35S（由实验室提供）、农杆菌菌株GV3101

2.1.3 主要试剂

75%酒精、84消毒液、侵染缓冲液、限制性内切酶、卡那霉素、壮观霉素（重组表达载体含有的抗性）、利福平

2.1.4 培养基

LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，15g/L琼脂（只固体培养基添加）

1/2MS培养基

2.2 实验方法

2.2.1 拟南芥种植：将种子放在浸过水的滤纸上，放在4℃的冰箱中，不见光培养24小时，然后取出种子种在营养土里，在光照强度8000Lux，温度25℃的培养箱中经过光照16小时/黑暗8小时培养[2]。

2.2.2 电转化将表达载体导入农杆菌

电转化准备：准备好要转化的表达载体质粒DNA，将农杆菌细胞处于感受态，并放在冰上解冻（约3-5min）。

（1）将放有感受态农杆菌细胞的冰桶转移到超净工作台，用移液器将质粒DNA和农杆菌细胞混合，并用移液器上下吹吸使其混匀。放于冰上3min。（2）将混合液转移到电转杯。（3）用电转电击3-5s。（4）取出电转杯，加入800l的LB液体培养基，混匀并转移至1.5ml的EP管中。（5）放于28℃下，振荡培养3h。（6）在此期间，配置添加有100g/ml壮观霉素抗性的LB固体平板，约15min培养基凝固后盖好盖，倒置放置。（7）将（5）的悬液离心。取出上上清液，放入800l LB培养基再培养。50min后涂板。（8）取20l LB培养基和30l转化农杆菌分别先后加入到平板。（9）放于28℃下培养两天。

2.2.3 质粒提取及鉴定

将以上转化出的菌斑挑取培養，在28℃下培养24h。

质粒用质粒提取试剂盒提取，并经酶切鉴定[3]

酶切体系（20L）：

DdH2O 14.9L

10×buffer 2L

质粒 3L

内切酶 0.1L

（37℃酶切0.5个小时）

2.2.4 农杆菌侵染拟南芥花序

侵染缓冲液的配置：200ml灭菌水、5g蔗糖、40L有机硅：（1）将经扩增的阳性菌株离心进行收集，弃去上清液。（2）将收集到的菌株沉淀悬浮于缓冲液中，并使其混合均匀。（3）用移液枪将上述混匀的悬浮液加入到拟南芥的花苞上，避光处理20分钟，等到菌液快干时再取些悬浮液滴到花苞上，最后将侵染后的拟南芥用保鲜膜包好，放在避光处过夜，次日揭掉保鲜膜，将侵染后的花苞暴露在日光下使其正常生长[2]。（4）培养一段时间后，获得成熟的拟南芥种子。

2.2.5 组织培养获得转基因植株

（1）种子的消毒处理：将拟南芥种子（T1）经75%酒精进行表面消毒2分钟，再用灭菌水清洗2次，然后加入84消毒液、灭菌水、Trition放在摇床上摇30分钟，最后用灭菌水清洗2-3次。（2）将灭菌后的种子用一定的琼脂悬浮均匀，用移液枪将悬浮好的拟南芥种子接种于添加50mg/L的1/2MS固体培养基上，封口膜封好，并做好标记[4]。于4℃冰箱中黑暗处理24h，后置于培养箱，条件为光照16小时/黑暗8小时，光照强度8000Lux，温度23℃[5]。（3）观察各种子的生长情况。黄化的子叶逐渐枯萎，绿色的子叶继续生长，即为转化成功。（4）当绿苗长到一定程度后，再移到营养土中培养。

3 结果与分析endprint

3.1 农杆菌的转化鉴定

对转化的农杆菌进行鉴定，结果如图1所示。

BamHI单酶切质粒，所得正确条带大小为：11000bp，10500bp，1400bp，521bp

第一条：重组表达载体PMDC150-35S，为正确条带。

第二条：PMDC150酶切对照

第三条：Marker

由转化鉴定图可以看出，酶切片段的大小和重组表达载体的大小几乎一致。结果表明农杆菌转化成功。

3.2 转基因拟南芥植株的筛选

對转基因植株进行筛选，在其他条件都相同的情况下，在分别含有37.5mg/L，40mg/L，50mg/L，60mg/L，70mg/L卡那霉素的选择培养基上进行培养筛选，结果如下表1：

表中数据表明，筛选的最适浓度为50mg/L。

因此选用含有50mg/L卡那霉素的MS培养基来培养植株，成活率最高，且非转基因幼苗会变黄而逐渐死亡，绿色的转基因植株得以存活。

4 结论

将含有35S启动子的基因载体PMDC150转入农杆菌后，再用转化后的农杆菌侵染拟南芥花序，培养后得到T1代种子，再用特定培养基筛选出绿色的转基因拟南芥植株。

由实验过程可以看出，农杆菌介导法具有较低成本、容易操作而转化成功率高等优点，但却受宿主细胞基因型的限制[6]。所以，根据植物的不同种类，我们要选择合理的转化方法，以达到理想的转化效果。

参考文献：

[1]翟晓巧.泡桐体外植株再生及反义LFY基因遗传转化研究[D].东北林业大学，2004.

[2]渠晓霞.拟南芥糖基转移酶基因的克隆、载体构建及转基因植物的研制[D].山东大学，2012.

[3]吴健谊，蒋太峰，许丽艳，等.哺乳动物细胞CDK3系列表达载体的构建与表达[J].汕头大学医学院学报，2010，23（3）：134-137.

[4]王明莉.碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因（ScBADH）的表达分析以及在拟南芥中的功能鉴定[D].吉林农业大学，2012.

[5]马新梅.拟南芥细胞分裂素O-糖基转移酶基因功能分析[D].山东大学，2011.

[6]冉翠香.植物基因工程中目的基因的转化方法[J].吕梁学院学报，2007，23（1）：3-6.endprint