老年直肠癌患者外周血与癌组织miR-141的表达及其临床相关性

冯 莉，吕雅蕾，常 靓，刘 妍，王 龙，徐志宏，王贵英

(河北医科大学第四医院：1.肿瘤内科，2.外二科，石家庄 050011)

论著·临床研究

老年直肠癌患者外周血与癌组织miR-141的表达及其临床相关性

冯 莉1，吕雅蕾1，常 靓1，刘 妍1，王 龙1，徐志宏1，王贵英2△

(河北医科大学第四医院：1.肿瘤内科，2.外二科，石家庄 050011)

目的 研究老年直肠癌患者外周血与癌组织微小RNA(miR)-141的表达及临床相关性。方法 75例直肠癌患者取直肠癌组织及癌旁正常组织并抽取肘静脉血，应用实时聚合酶联法检测直肠癌、癌旁正常组织标本和外周血中miR-141的表达水平，分析直肠癌组织和外周血miR-141的相关性，外周血miR-141与临床病理特征和临床预后的关系。结果 (1)与健康体检者外周血或者与正常癌旁组织相比，miR-141的表达水平在直肠癌患者外周血和直肠癌组织中均明显下调(P<0.01)；(2)有淋巴结转移的患者中直肠癌组织miR-141水平与外周血miR-141水平呈正相关(r=0.694，P<0.01)，无淋巴结转移的患者中直肠癌组织miR-141水平与外周血miR-141水平呈正相关(r=0.725，P<0.01)；(3)直肠癌患者外周血miR-141表达与肿瘤分期、肿瘤分化程度和有无淋巴结转移相关；(4)术后6个月随访显示，75例患者中有13例(17.33%)患者出现复发/转移，复发/转移患者外周血miR-141水平为(2.64±0.34)，显著低于未复发/转移患者(P<0.01)。结论 miR-141在直肠癌患者外周血中表达与在癌组织中表达变化趋势一致，可反映直肠癌的临床病理特征。

直肠肿瘤；老年人；微RNAs;预后；miRNA-141

直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，目前随着社会发展和人民生活水平的提高，其发病率也呈上升趋势，居消化道肿瘤第2位[1]，并且以4.2%的平均速度逐年递增[2-3]。结直肠癌的早期筛查与诊断越来越受到人们的关注。近年来新发现的微小RNA(microRNA，miR) 是一类非编码小RNA分子，由20～24个核苷酸组成。miR可抑制miR的翻译，并诱导miR的切割降解[4]。近年来大量研究证实，miR可发挥抑癌基因或癌基因的作用，通过负调控基因表达，参与恶性肿瘤的发生、发展过程，miR有望成为肿瘤的早期诊断、特异性治疗及评估预后的标志物。目前对miR在肿瘤患者中表达的研究主要集中于肿瘤组织样品中，而以血清作为样品的研究较少。已有研究显示，miR-21在结直肠癌、食管鳞状细胞癌等患者血清中表达上调，提示其有望应用于多种恶性肿瘤的早期诊断和预后评估[5-6]。有报道发现，miR-141在结直肠癌患者血清中的表达水平显著高于健康人，结肠癌血清miR-141水平与临床分级和预后密切相关[7]。由于miR-141在不同肿瘤中作用不同，如在头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、女性生殖系统肿瘤和肾细胞癌中具有抑制肿瘤迁移、侵袭、增殖和耐药的作用[8-10]，但在卵巢癌中miR-141会促进肿瘤细胞增殖和耐药性[11-12]。本研究探讨直肠癌组织与血清miR-141的相关性，分析其与直肠癌的发展和预后的相互关系，为结直肠癌预后的推测及治疗寻求一种简便、可靠的检测方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究的直肠癌患者为 2014年1～12月在本院收治的患者，最后共纳入75例。患者的纳入标准：(1)年龄大于或等于60岁；(2)经过组织病理学确诊为直肠癌；(3)为避免治疗的影响，所有纳入对象均未经过放疗或化疗。对象纳入的直肠癌患者中男43例(57.33%)，女32例(42.67%)；年龄60～72岁，平均(65.26±6.52)岁；肿瘤直径2.4～7.3 cm，平均(4.63±1.58)cm；肿瘤TNM分期Ⅰ期13例(17.33%)、Ⅱ期31例(41.33%)、Ⅲ期24例(32.00%)、Ⅳ期7例(9.34%)；黏膜下层浸润46例(61.33%)、黏膜层浸润29例(38.67%)；距肛缘距离大于或等于5 cm 40例(53.33%)，距肛缘距离小于5 cm 35例(46.67%)；高度分化16例(21.33%)、中度分化23例(30.67%)和低度分化36例(48.00%)；无淋巴结转移31例(41.33%)、有淋巴结转移44例(58.67%)。同时按照年龄和性别配比选取同期在本院体检中心健康体检者40例作为对照，年龄60～75岁，平均(66.45±5.96)岁；男22例(55.00%)、女18例(45.00%)。两组受试者年龄和性别差异均无统计学意义(P>0.05)。所有对象均签署知情同意书，研究经本院伦理委员会审核通过。

1.2 主要试剂 mirVanaTMPARISTMmiRNA试剂盒，由美国Applied Biosystems提供；FAST1000试剂盒，由北京先锋生物公司提供；Affymetrix 逆转录试剂盒，由美国Qiagen 公司提供；Micrornas实时聚合酶联反应(real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测试剂盒，由北京艾德莱生物科技公司；miR-141及内参U6引物设计与合成由北京艾德莱生物科技公司提供，miR-141的引物序列为5′-CCG GTA ACA CTG TCT GGT AA-3′，内参U6的引物序列为5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′。

1.3 主要仪器 紫外可见分光光度仪，由德国Eppendorf公司提供；ABI step one荧光定量PCR仪，由美国ABI公司提供；GeneGenius全自动凝胶成像系统，由美国Syngene公司提供。

1.4 试验方法 提取受试者外周血和直肠标本的RNA，采用Real-time PCR法测定直肠病理组织。

1.4.1 RNA提取 抽取受试者空腹肘静脉血5 mL，室温下静置30 min，待血液完全凝固后离心分离血清。取血清采用mirVanaTMPARISTMmiRNA试剂盒提取总RNA。直肠组织RNA提取采用FAST1000试剂盒进行。称取100 mg直肠癌组织或癌旁正常组织并加入裂解液，研磨，吸取裂解液后加入氯仿进行混匀，离心，加入聚合液并转移至内套管，洗脱液洗脱2次，高速离心，将内套管移入EP内，膜中央加洗脱液RNase-free H2O，静置，离心，即得。所得RNA 经紫外分光光度法测定浓度，吸光度A260/A280为1.8～2.1的RNA样品于-80 ℃保存。

1.4.2 RT-PCR 采用Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit，以总RNA为模板，miR-141 特异性逆转录引物进行逆转录反应得cDNA。逆转录条件如下：16 ℃ 30 min；42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min。将逆转录所得cDNA纯化后应用Micrornas RT-PCR检测试剂盒在ABI step one荧光定量PCR仪进行PCR扩增。反应总体积为20 μL：1.5 μL cDNA 模板，1 μL miR-141或U6引物，10 μL miRNA qPCR Mix，7.5 μL H2O。PCR反应条件为:94 ℃预变性3 min，然后以94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s和72 ℃ 40 s，循环40次。以U6 为参照，采用2-△△Ct计算目标基因的相对表达量。

1.5 临床治疗和疗效评价 所有Ⅰ期患者根治术后观察随访，Ⅱ～Ⅲ期患者根治术后接受辅助放化疗，Ⅳ期患者姑息术后接受一线化疗。化疗方案均采用mFOLFOX6方案(奥沙利铂85 mg/m2，静脉滴注大于2 h，第1天；四氢叶酸钙400 mg/m2，静脉滴注2 h，第1天；氟尿嘧啶0.4 g/m2，静脉推注，2.4 g/m2，持续静脉输注46～48 h；每2周为1个周期)或XELOX方案(奥沙利铂130 mg/m2，静脉滴注大于2 h，第1天；卡培他滨 850～1000 mg/m2，每天两次口服，第1～14天；每3周为1个周期)。术后辅助放疗于术后2个月内在本院放疗科实施。术后6个月观察肿瘤复发/转移情况。

2 结 果

2.1 组织及外周血miR-141的表达 直肠癌患者直肠癌组织miR-141表达水平(5.13±0.62)较癌旁正常组织(8.67±0.95)明显下调(t=27.025，P<0.01)；直肠癌患者外周血miR-141水平(3.54±0.44)较健康体检者(6.24±0.76)明显下调(t=20.409，P<0.01)。见图1、2。

A、B、C：直肠癌组织，D、E、F：癌旁正常组织。

图1 直肠癌组织和癌旁正常组织miR-141的表达

A、B、C：直肠癌患者，D、E、F：正常体检者。

图2 直肠癌患者和健康体检者外周血miR-141的表达

2.2 直肠癌组织与外周血miR-141水平的相关性分析 有淋巴结转移的患者中直肠癌组织miR-141水平与外周血miR-141水平呈正相关(r=0.694，P<0.01)，无淋巴结转移的患者中直肠癌组织miR-141水平与外周血miR-141水平亦呈正相关(r=0.725，P<0.01)。

2.3 外周血miR-141表达与直肠癌临床病理特征的单因素分析 对外周血miR-141的表达水平与直肠癌临床病理特征进行单因素分析后，发现miR-141表达水平与研究对象的年龄、性别、肿瘤直径、浸润程度、距肛缘距离不存在明显的关联(P>0.05)，但是随着患者肿瘤分期的增大血液miR-141表达下调(P<0.01)，随着患者肿瘤分化程度降低而血液miR-141表达下调(P<0.01)，有淋巴结转移的患者较无淋巴结转移的患者其血液miR-141表达下调(P<0.01)。见表1。

2.4 外周血miR-141水平与临床疗效的相关性分析 术后6个月随访时共有13例(17.33%)患者出现肿瘤复发/转移。出现肿瘤复发/转移的患者和未出现肿瘤复发/转移的患者其术前外周血miR-141水平分别为(2.64±0.34)和(5.65±0.56)，差异有统计学意义(t=18.613，P<0.01)。

表1 外周血miR-141表达与直肠癌临床病理特征的关系

3 讨 论

近年来由于生活方式加快、饮食习惯等改变，直肠癌发病率、病死率呈不断上升趋势[13]。伴随老龄化现象，直肠癌老年患者的数量增长更为显著[14]。miRs 是一类内生、小分子非编码的调控RNAs，由20～24 个核苷酸短序列组成，3′端有1～2个碱基长度变化。在人类基因组中约有900多种特定的miR，其中1/3由miRs调控[15]。miRs 在机体各种生理及病理过程中发挥重要作用，并且有可能成为肿瘤的早期诊断、特异性治疗及评估预后的标志物。miRs在肿瘤中具有特定的表达模式，在肿瘤患者的循环核酸中存在源自肿瘤的miRs 分子，并且较高的稳定性和特异性，因此血清miRs有望成为肿瘤无创诊断的新型分子标志物。由于外周血样品检测具有非创伤性、可重复测试、多指标及同时检测等优点，适合于所有癌症患者尤其适用于年老体弱患者的随访，故血清miRs的检测更适于临床应用。miR-200家族是近年来研究比较集中的热点，miR-141作为miR-200家族成员，具有上皮组织细胞特异性的miRs，在维持上皮细胞表型稳定方面发挥重要作用，但当其表达失调时可促进细胞表型上皮-间质转换并导致上皮来源肿瘤的增殖、侵袭、转移。众多研究显示，miR-141 与结直肠癌、子宫癌、前列腺癌、肝细胞肝癌、肾透明细胞癌及子宫内膜癌等恶性肿瘤的发生和发展密切相关，与胆管癌细胞的增殖和肾透明细胞癌的侵袭活动有关，提示miR-141与多种肿瘤的发病机制及转移等有关[16-19]。

血清miRs在诊断方面的作用是近年来研究的热点。血清miRs 表达稳定、取材方便、损伤性小，并且可以耐受RNase 消化、反复冻融、强酸强碱、高温煮沸等条件而不被破坏[20]，提示循环miR可以作为一种无创性生物标志物，用于诊断、预后等判断[21]。本研究结果显示，直肠癌组织miR-141表达水平较癌旁正常组织明显下调(P<0.01)，并且外周血miR-141水平较健康体检者明显下调(P<0.01)，提示在直肠癌的发生、发展中miR-141可能作为抑癌基因发挥重要作用，这点与其在结肠癌发生和发展中的作用不同。有淋巴结转移的患者中直肠癌组织miR-141水平与外周血miR-141水平呈正相关(r=0.694，P<0.01)，无淋巴结转移的患者中直肠癌组织miR-141水平与外周血miR-141水平亦呈正相关(r=0.725，P<0.01)。因此，无论直肠癌患者是否发生淋巴结转移，癌组织miR-141水平与外周血miR-141水平均呈正相关。分析外周血miR-141与直肠癌临床病理参数相关性结果显示，血液miR-141表达与年龄、性别、肿瘤直径、浸润程度、距肛缘距离无明显相关性(P>0.05)，提示患者的年龄、性别并不影响外周血miR-141的表达，同时miR-141的表达水平也不能指示肿瘤大小、浸润程度或者直肠癌的位置。患者肿瘤分期越晚及肿瘤分化程度越低血液miR-141表达下调(P<0.01)，并且有淋巴结转移的患者较无淋巴结转移的患者血液miR-141表达下调(P<0.01)，提示血液miR-141与直肠癌分化、转移相关，而肿瘤的分化、转移等与患者预后有直接相关性。已有研究表明，血浆miR-141水平是检测Ⅳ期结肠癌的敏感标志，并且血浆中miR-141水平与患者短期生存情况密切相关，推测其可独立作为结肠癌预后的指标[22]。另有研究显示，结肠癌组织中miR-141的表达量和癌旁正常组织显著不同，并且结肠癌组织的分化程度不同则miR-141的表达不同，并且结肠癌转移患者和非转移患者结肠癌组织中miR-141的表达量不同，提示miR-141的表达可能与结肠癌的分化程度和淋巴结有无转移相关[23]。在本研究中，术后6个月出现肿瘤复发/转移的直肠癌患者和未出现肿瘤复发/转移的患者其术前外周血miR-141水平分别为(2.64±0.34)和(5.65±0.56)，差异有统计学意义(t=18.613，P<0.01)，说明外周血miR-141水平与直肠癌患者的临床预后密切相关。虽然对于血清中miR-141的来源尚不确定，目前有观点认为其来自于凋亡或坏死的细胞，细胞的主动释放，以及循环细胞的裂解，但是由于考虑其具有稳定、取材方便、损伤性小的优点，并且与肿瘤组织中miR-141表达水平呈正相关，并且与患者临床预后密切相关，因此可考虑作为直肠癌患者临床预后的判断指标。

总之，miR-141在直肠癌患者外周血中的表达与在癌组织中表达变化趋势一致，可反映直肠癌的病理特征，可考虑作为直肠癌临床预后的备选生物学标记物。

[1]文莎丽，张静平.直肠癌结肠造口患者家属焦虑、抑郁状况及其影响因素研究[J].中国全科医学，2013，16(7A)：2291-2293.

[2]Agüero F，Murta-Nascimento C，Gallén M，et al.Colorectal cancer survival：results from a hospital-based cancer registry[J].Rev Esp Enferm Dig，2012，104(11)：572-577.

[3]Arredondo J，Baixauli J，Beorlegui C，et al．Prognosis factors for recurrence in patients with locally advanced rectal cancer preoperatively treated with chemoradiotherapy and adjuvant chemotherapy[J].Dis Colon Rectum，2013，56(4):416-421.

[4]Lam TK，Shao S，Zhao Y，et al.Influence of quercetinrich The food intake on mirna expression in lung cancer tissues [J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2012，21(12)：2176 -2184.

[5]Toiyama Y,Takahashi M,Hur K,et al.Serum miR-21 as a diagnostic and prognostic biomarker in colorectal cancer[J].J Natl Cancer Inst,2013,105(12):849-859.

[6]Kurashige J,Kamohara H,Watanabe M,et al.Serum microRNA-21 is a novel biomarker in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J].J Surg Oncol,2012,106(2):188-192.

[7]马一楠，金迎迎，王亚利，等.miR-141表达抑制增强结肠癌细胞对5-Fu药物敏感性的研究[J].山西医科大学学报，2016，47(6)：510-517.

[8]Chen X，Wang X，Ruan A，et al.miR-141 is a key regulator of renal cell carcinoma proliferation and metastasis by controlling EphA2 expression[J].Clin Cancer Res，2014，20(10)：2617-2630.

[9]Marchini S，Cavalieri D，Fruscio R，et al.Association between miR-200c and the survival of patients withstage Ⅰ epithelial ovarian cancer:a retrospective study of two independent tumour tissue collections[J].Lancet Oncol，2011，12(3)：273-285.

[10]Ceppi P，Mudduluru G，Kumarswamy R，et al.Loss of miR-200c expression induces an aggressive，invasive，and chemoresistant phenotype in non-small cell lung cancer[J].Mol Cancer Res，2010，8(9)：1207-1216.

[11]van Jaarsveld MT，Helleman J，Boersma AW，et al.miR-141 regulates KEAP1 and modulates cisplatin sensitivity in ovarian cancer cells[J].Oncogene,2013,32(36)：4284-4293.

[12]Hur K，Toiyama Y，Takahashi M，et al.MicroRNA-200c modulates epithelial-to-mesenchymal transition(EMT) in human colorectal cancer metastasis[J].Gut，2013，62(9)：1315-1326.

[13]Taylor FG，Quirke P，Heald RJ，et al.Preoperative high- resolution magnetic resonance imaging can identify good prognosis stage Ⅰ，Ⅱ，and Ⅲ rectal cancer best managed by surgery alone:a prospective，multicenter，European study[J].Ann Surg，2011，253(4)：711-719.

[14]Ozden SA，Ozyurt H，Ozgen Z，et al.Prognostic role of sensitive-to-apoptosis gene expression in rectal cancer[J].World J Gastroenterol，2011，17(44)：4905-4910.

[15]Kim VH，Han J，Siomi MC.The Biogenesis of small RNAs in animals[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10(2)：126-139.

[16]Gonzales JC，Fink LM，Goodman Jr OB，et al.Comparison of circulating microRNA 141 to circulating tumor cells，lactate dehydrogenase，and prostate-specific antigen for determining treatment.The response in patients with metastatic prostate cancer [J].J Clin Genitourin Cancer，2011，9(1)：39-45.

[17]Lee TS，Jeon HW，Kim YB，et al.The Aberrant mirna expression in Endometrial carcinoma using formalin - fixed paraffin - embedded(FFPE) tissues [J].PLoS One，2013，8(12)：e81421.

[18]Liu Y，Ding Y，Huang J，et al.MiR-141 suppresses the migration and night of HCC cells by targeting Tiam1 [J].PLoS One，2014，9(2)：e88393.

[19]Yu XY，Zhang Z，Liu J，et al.MicroRNA- 141 is downregulated in human renal cell carcinoma and regulates cell survival by targeting CDC25B [J].Onco Targets Ther，2013，10(6)：349-354.

[20]Davalos V，Moutinho C，Villanueva A，et al.Dynamic epigenetic regulation of the microRNA - 200 family mediates epithelial and mesenchymal transitions in human tumorigenesis[J].Oncogene，2012，31(16)：2062-2074.

[21]Vrba L，Jensen TJ，Garbe JC，et al.Role for DNA methylation in the regulation of miR -200c and miR -141 expression in normal and cancer cell[J].PLoS One，2010，5(1)：e8697.

[22]Cheng H，Zhang L，Cogdell DE，et al.The Circulating plasma MiR-141 is will be a biomarker for metastatic colon cancer and predicts poorprognosis[J].PLoS One，2011，6(3)：e17745.

[23]王亚南，陈昭华，陈卫昌，等.microRNA-141在结肠癌中的表达分析研究[J].重庆医学，2015，44(16)：2250-2252.

Expression and clinical correlation of miR-141 in peripheral blood and tumor tissue in elderly patients with rectal cancer*

FengLi1,LvYalei1,ChangLiang1,LiuYan1,WangLong1,XuZhihong1,WangGuiying2△

(1.DepartmentofOncology;2.SecondDepartmentofSurgery,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050011,China)

Objective To study the expression and clinical correlation of miR-141 in peripheral blood and tumor tissue in elderly patients with rectal cancer.Methods Rectal tumor tissue and tumor-adjacent normal tissues were taken in 75 cases of rectal cancer.The expression levels of miR-141 in peripheral blood and tumor tissue as well as tumor-adjacent normal tissues were determined by real-time polymerase chain reaction method.The correlation of miR-141 expression between peripheral blood and tumor tissue,and the correlation of peripheral blood miR-141 with clinicopathologic features and clinical prognosis were analyzed.Results (1) Compared with peripheral blood in the subjects undergoing normal physical examination or tumor-adjacent normal tissue in the patients with rectal cancer,the miR-141 expression level in peripheral blood and tumor tissue in the patients with rectal cancer was decreased significantly (P<0.01).(2) The cancer tissue miR-141 level in the patients with lymph node metastasis was positively correlated with peripheral blood miR-141 level (r=0.694，P<0.01),and cancer tissue miR-141 level in the patients without lymph node metastasis was positively correlated with peripheral blood miR-141 level (r=0.725，P<0.01).(3) The differences between peripheral blood miR-141 level with tumor stage,tumor differentiation degree and lymphatic metastasis had statistical significance (P<0.01).(4)The postoperative 6-month follow up displayed that among 75 cases,13 cases(17.33%) appeared replase/ metastasis,and peripheral blood miR-141 level was (2.64±0.34),which was significantly lower than that in the patents without replase/metastasis (P<0.01).Conclusion Expression variation trend of miR-141 in peripheral blood is similar to that in tumor tissue,which can reflect the clinicopathologic feature in the patients with rectal patients.

rectal neoplasms;aged;microRNAs;prognosis;miRNA-14

河北省卫生厅医学科学研究重点课题(20150769)。

冯莉(1982-)，主治医师，博士，主要从事消化道恶性肿瘤的临床与基础研究。

△通信作者，E-mail:wgy777@yeah.net。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.24.008

R735.2

A

1671-8348(2017)24-3339-04

2016-12-22

2017-03-10)