鹅绒藤叶斑病两种致病菌的鉴定*

姜 一，张 琳，王仲敏

（1.天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津 300456； 2.沈阳市第一私立高级中学，辽宁 沈阳110043）

鹅绒藤叶斑病两种致病菌的鉴定*

姜 一1，张 琳2，王仲敏1

（1.天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津 300456； 2.沈阳市第一私立高级中学，辽宁 沈阳110043）

鹅绒藤（Cynanchum chinense R.Br.）是一种很有开发价值的野生药用植物资源，其汁液具有抗肿瘤等多种功效，但其栽培中易发生叶斑病。从鹅绒藤感病叶片中单斑分离出2株真菌，P1单斑分离率为68.18%、P2为6.82%，侵染试验证明二者均具侵染性；形态学与分子生物学鉴定证明，P1为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、P2为球黑孢（Nigrospora sphaerica）。P1菌丝在15～30℃下能生长但最适为24℃、致死为63℃，最适pH为7，最适湿度为50%，菌丝适宜全黑暗下生长；蔗糖是最适碳源、尿素是最适氮源、NaH2PO4是最适无机盐、维生素B1是最适生长因子；培养2～3 d为菌丝速长期，第5天可见菌核产生，未见孢子产生。P2菌丝在5～35℃下能生长但最适为24℃、致死为68℃，最适pH为8，最适湿度为90%，菌丝生长宜黑暗条件；D-果糖为最适碳源、酵母膏为最适氮源、K2HPO4为最适无机盐、萘乙酸为最适生长因子；培养2～3 d为菌丝速长期，第4天可见孢子产生，在15～35℃能产孢但最适为24℃，孢子萌发最适温度为25℃、最适pH为8、最适湿度为90%、光照利产孢但黑暗宜孢子萌发。

鹅绒藤；立枯丝核菌；球黑孢

鹅绒藤（Cynanchum chinenseR.Br.）是多年生草本植物，属于萝藦科（Asclepiadacea）鹅绒藤属（Cynanchum）。全世界约有鹅绒藤属植物200多种、我国约57种，辽宁等众多省份都有分布，多生长于荒郊野岭等非农用耕地上［1］。鹅绒藤全草含有甾体、生物碱、氨基酸、蛋白质、糖及糖苷、鹅绒藤酯等多种成分［2，3］，可从中分离到蛋白酶、黄酮甙类化合物、萜酯及有机酸，可纯化出巯基蛋白酶［4，5］。作为民间药材，鹅绒藤很早就被我国使用，因其全草味苦、性凉，可用于去火、止泻；根和乳汁可用于根治风湿痛、腰痛、胃痛等；乳汁可外用，治疗疣赘和甲癣等［6］。鹅绒藤生物总碱（CCTA）是许多药用植物的有效成份，具有免疫调节作用和多种生物活性，可杀菌抑毒、抗肿瘤［7］。笔者调查发现，自然生境下的鹅绒藤植株，叶斑病发生严重，但前人对鹅绒藤的研究，多关注化学成分、药理药效等药用价值，而有关其病害、病原菌研究鲜有报道。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

鹅绒藤（Cynanchum chinenseR.Br.）叶斑病感病植株与健康植株，采自大连市甘井子区；病原菌形态学鉴定采用PDA培养基；分子生物学鉴定使用的试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTP等购于大连宝生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 病原菌分离纯化

采用单斑和单孢分离法［8］。

1.2.2 病原菌鉴定

将单孢分离纯化的菌株接种于PDA平板上，培养5 d后依据菌落和菌体形态，进行形态学的初步鉴定［9］；再依据真菌的 rDNA-ITS区设计PCR扩增引物ITS1和ITS4，进行分子生物学鉴定［10］；PCR产物测序，交由上海生工完成；使用BLAST和MEGA 5.1软件，将测得的菌株ITS序列，在NCBI网站上进行序列比对及序列分析；采用邻接法（M-E）构建系统发育树及同源性分析，最终确定病原菌的分类地位。

1.2.3 致病性测定

采用针刺接种法。健康叶片接种P1、P2、P1和P2混合液，28℃保湿培养，接种发病后再行单斑分离鉴定，统计发病率。3次重复［8］。

1.2.4 病原菌生物学特性测定

培养基采用PDA平板，测量菌落大小以十字交叉法；计算产孢量以血球计数板法；孢子保湿培养以玻片悬滴法；湿度测定以小容器空气湿度调节法，测定温、湿度的梯度为5、pH范围为4～12［8］；最适碳源、氮源、无机盐及生长因子的筛选，参照张琳论文方法［1］。实验均3次重复。

2 实验结果与分析

2.1 鹅绒藤叶斑病症状

病害症状如图1所示，主要发病部位为叶片。初期，病叶感病部位褪绿、逐渐形成椭圆形或不规则形的枯斑；枯斑中心灰色、斑周围深褐色，严重者形成穿孔；病斑无纶纹、分布无规则，病情严重的整叶枯死。

2.2 病原菌的分离

从鹅绒藤叶斑病的感病叶片中共分离出4株真菌，分别命名为P1、P2、P3和P4，其单斑分离率分别为68.18%、6.82%、6.82%和6.82%；对照健康组叶片均无真菌菌落生长。

2.3 病原菌的致病性检测

针刺法接种、保湿培养2 d后，观察接种叶感病症状、调查发病率，结果如表1。P1与P2无论是单独接种或是混合接种，均可导致叶片发病，混合接种的发病率高于单菌株接种，由此认为，鹅绒藤叶斑病的主要致病菌是P1，且由P1与P2混合侵染所致；P3和P4的接种叶片均不发病，因此说他们不是鹅绒藤叶斑病的致病菌。

2.4 病原菌鉴定

2.4.1 形态学鉴定

鉴定结果见图2和图3。P1：菌落正反面均灰白色，松散、绒毛状，无波纹，不产孢子。菌丝浅褐色或深褐色，分枝、有隔膜，分枝角度始近直角后为锐角，且分枝菌丝在发生点缢缩并形成隔膜；能形成菌核但无孢子产生。依此特征初步判断P1为丝核菌属、多核丝核菌群的立枯丝核菌［9，10］。

P2：菌落正面白色、絮状、有波纹，反面淡黄色；产孢细胞近球形、无色；分生孢子梗聚生、无分枝、淡褐色，具1～2个隔膜，直形或微弯，顶端细胞膨大；分生孢子单生于顶端，球形或扁球形、黑褐色、光滑，直径30～40 um。依此特征初步认为P2菌为球黑孢霉菌属的球黑孢［9］。

2.4.2 分子生物学鉴定

提取单孢纯化的P1和P2的DNA，以真菌通用引物（ITS1和ITS4）进行PCR，扩增产物纯化、测序，获得两株菌的rDNA-ITS碱基序列；再进行Blast比对、系统进化树同源性分析，其结果表明：致病菌P1属于立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），P2属于黑孢霉属球黑孢（Nigrospora sphaerica）。分子生物学鉴定结果进一步确证了形态学鉴定结果的正确。

2.5 两种致病菌的生物学特性比较

2.5.1 温度、pH、湿度、光照、培养时间等因素对菌丝生长、产孢量及孢子萌发的影响

温度的影响：P1菌丝最适生长温度为24℃、致死温度为63℃，菌丝在15～35℃范围内能生长但不产孢，低于10℃不生长、低于15℃或高于28℃生长不良。P2菌丝最适生长温度为24℃、致死温度为68℃，菌丝在5～35℃范围内能生长，低于15℃或高于30℃生长不良；最适产孢温度为24℃，在15～30℃范围内均能产孢，孢子致死温度为70℃；P2孢子培养8 h以上才可萌发，最适萌发温度为25℃、低于15℃孢子不萌发，在培养8～24 h内孢子萌发率高。

pH的影响：两种菌在pH为4～10的条件下均能生长，但P1菌丝生长的最适pH为7，而P2菌丝生长、产孢及孢子萌发的最适pH均为8；P2孢子在pH为4～6范围内均不萌发。

湿度的影响：P1适宜低湿环境，其菌丝最适生长湿度为50%；P2适宜高湿环境，其菌丝生长、产孢及孢子萌发的最适湿度为90%，孢子在湿度为30～90%可萌发，湿度低于50%则不产孢。

光照的影响：全黑暗利于P1和P2的菌丝生长，但全光照利于P2产孢；P2孢子在全光照、全黑暗、12 h光照、12 h黑暗交替条件下均可萌发，但全黑暗更宜孢子萌发。

培养时间的影响：培养第3天，调查了二者的菌落直径和生长速率，P1的为3.137 cm和1.197，而P2为4.109 cm和1.528，二者比较P2比P1菌落直径大、生长速率高。培养第4天时P2开始产孢，但此时菌丝生长速率变缓；第6天时P1菌丝生长速度变缓，但未见孢子产生，可见菌核产生。P2孢子在全黑暗条件下培养8～24 h萌发。

2.5.2 最适营养源

经筛选，P1菌丝生长的最适碳源、氮源、无机盐及生长因子分别是：蔗糖、尿素、NaH2PO4和维生素B1。P2菌丝生长的最适碳源、氮源、无机盐及生长因子分别是：D-果糖、酵母膏、K2HPO4和萘乙酸；P2产孢的最适碳源、氮源、无机盐及生长因子分别是：蔗糖、酵母膏、CaCl2和维生素B2。

图1 鹅绒藤叶斑病症状（健叶片与病叶片）Figure 1 The Cynanchum chinense R．Br．leaf spot’s sym ptom s

表1 鹅绒藤叶斑病分离菌株的致病性检测Table 1 The Pathogenic detection of the fungi separated from the Cynanchum chinense R．Br．leaf spot

图2 病原菌菌落正反面形态（①为P1，②为P2）Figure 2 The purified four fungal colonies front and back

图3 P1和P2的菌丝及孢子形态（①为P1，②为P2）Figure 3 Hyphae and spores of P1 and P2

3 讨论

鹅绒藤体内含有多种活性成分，具有较高的药用价值，作为一种野生植物资源，值得深入研究和开发，但目前有关其病原菌等研究国内外鲜有报道。文中以形态学鉴定法及分子生物学鉴定法，查明了引起鹅绒藤叶斑病的病原菌是立枯丝核菌Rhizoctonia solani（P1）和球黑孢Nigrosporasphaerica（P2）。立枯丝核菌是常见的土壤真菌，可引起水稻等粮食作物、花生等经济作物、苹果等果树、白菜等蔬菜多种植物病害［11，12］。球黑孢在土壤及腐烂植物种子上分布广泛，可导致麦和草坪枯萎病、玉米轴裂病、狗牙草和竹子叶斑病、柏树枯死等多种病害［13～16］。分离出的两种病原菌中的立枯丝核菌分离率较高，为68.16%，而球黑孢菌分离率较低为6.82%，但二者都具有致病性，由此认为立枯丝核菌是鹅绒藤叶斑病的主要致病菌。生物学特性表明，立枯丝核菌不耐热、喜干，对于湿热环境的适应能力较弱，而球黑孢菌耐热、喜湿，适应能力较强。鹅绒藤叶斑病发病期为6月中旬，此时的温、湿度不高，比较适宜丝核菌的侵染和生长，而8～9月的气温较高且较湿润，利于球黑孢的生长。二者的生物学特性可以作为栽培防病的参考。

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Two Kinds of Pathogen Identification of Cynanchum Chinense R.Br.Leaf Spot Disease

JIANG Yi1，ZHANG Lin2，WANG Zhong-min1
（1．Animal＆Plant＆Foodstuffs Inspection Center，Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjn 300456； 2．Shenyang NO．1 Private Middle School，Shenyang，Liaoning 110043）

Ofwild drugs，theCynanchum chinenseR.Br.has great development potential on the research.The extracts of its juice can resist tumor.But the Cynanchum chinenseR.Br.easily has leaf spot disease in grows.Two fungiwhich separated from the leaves infected leaf spot was named P1 and P2.The single spot separation rate of them are 68.18%and 6.82%.Both of them have infection is proved by the infection experiments.The P1 is proved to beRhizoctonia solaniand the P2 isNigrospora sphaericaby themolecular biology techniques and themorphological observations.P1：Mycelia can grow from 15℃to 30℃，but the 24℃was the optimum growth temperature，and the 63℃ is its lethal temperature.The optimum pH is 7 and the optimum humidity is 50%.Themycelial will grow well if the environment is dark.The optimum carbon source was sucrose，the nitrogen source is urea，the NaH2PO4is themost suitable inorganic salt，and the vitamin B1 is the optimum growth factor.Mycelia rapid growth period is about 2～3 d.After five days，the sclerotinia sclerotiorum can be found，but the spore can’t be found.P2：Mycelia can grow from 5℃ to 30℃；the optimum growth temperature was 24℃，68℃ is the lethal temperature，and the optimum pH is 8，the optimum humidity is 90%.Themycelial grow wellwhen the environment is dark，the D-fructosewas the optimum carbon source；the nitrogen source is yeast，and the K2HPO4was themost suitable inorganic salt，and the optimum growth factor is naphthyl acetic acid.Mycelia rapid growth period is about 2～3 d，the spore can be found after four days.The spore of the P2 can sporulated in 15～35℃，the optimal sporulation temperature is 24℃，and the spore germination optimum temperature is 25℃，pH 8 is the optimum pH，the optimum humidity is90%.The sporeswill bemake in Lightenvironmentbut dark environment is suitable for spore germination.

Cynanchum chinenseR.Br.；Rhizoctonia solani；Nigrospora sphaerica

Q939；S41

A

1002－1728（2017）04－0015－04 doi：10.3969／j.issn.1002－1728.2017.04.004

2017－04－19

天津出入境检验检疫局科技计划项目（tk001-2016）

姜一（1984－），女，黑龙江齐齐哈尔人，从事植物病理学研究。