地衣芽孢杆菌发酵土鳖虫前后水溶性活性物质含量比较及抗凝血活性

王立娜，王 颖，朱明珠，桑 晓，毛会秀，邢佰颖，孙 鹏

(山东中医药大学 药学院,山东 济南 250355)

地衣芽孢杆菌发酵土鳖虫前后水溶性活性物质含量比较及抗凝血活性

王立娜，王 颖，朱明珠，桑 晓，毛会秀，邢佰颖，孙 鹏*

(山东中医药大学 药学院,山东 济南 250355)

目的：比较未发酵和经地衣芽孢杆菌发酵后蛋白质、多糖含量的差别，并研究土鳖虫经地衣芽孢杆菌发酵后的抗凝血活性；方法：通过改良Lowry 法、苯酚-硫酸法分别测定蛋白质、多糖含量，以凝血酶原时间 (PT)、部分活化凝血活酶时间 (APTT) 、凝血酶时间 (TT) 为指标评价抗凝血活性。结果：水溶性蛋白质发酵前后含量为65.2061 mg/g，55.9015 mg/g，多糖为46.9724 mg/g，84.8736 mg/g；发酵后能显著延长小鼠的 APTT、TT值，但对PT 值则无明显影响。结论：土鳖虫经地衣芽孢杆菌发酵后能显著提高多糖含量，明显降低蛋白质含量，并且发酵后具有更强的抗凝效果。

地衣芽孢杆菌；土鳖虫；活性物质；抗凝血

土鳖虫又名地鳖、土别虫，是鳖蠊科昆虫地鳖(Eupolyphaga sinesis Walker)或冀地鳖(Eupolyphaga sinesis(Boleny))的雌虫干燥体[1]，性寒味咸，通心肝脾，是传统的活血化瘀类中药[2]。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，属芽孢杆菌科细菌，为革兰氏阳性杆菌[3]，能产生多种营养物质，如纤溶酶。虫类中药发酵是生物转化技术的最新应用，其微生物通过本身含有或者经生物转化产生的酶及其强大的分解转化能力，不仅可以对培养基中的纤维、糖类和蛋白加以利用[4]，而且在代谢的过程中可以对中药中的成分进行转化修饰，把一些难以吸收的大分子蛋白质、糖类分解成葡萄糖氨基酸，易于吸收[5]。且研究表明，中药红花经地衣芽孢杆菌C2-13发酵炮制后，可以明显使内源性及外源性凝血系统得到抑制，纤溶酶活性显著提高[6]。受此启发，本实验以地衣芽孢杆菌为发酵菌，土鳖虫粉为底物，进行双向固体发酵，比较其发酵前后水溶性蛋白质、多糖的含量差异，为其发酵过程中有效成分的鉴别提供依据，以及研究土鳖虫经地衣芽孢杆菌发酵后抗凝血活性，并与未发酵土鳖虫粉作为对比，探究其抗凝活性是否有所提高，为抗凝血活性成分的制备和新药研发提供新思路和新方法，丰富虫类中药发酵炮制的研究。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级小鼠，雄性，体质量(18-20)g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。

1.2 药品与试剂

土鳖虫粉(山东中医药大学实验室自制，批号20160821)，经山东中医药大学高德民老师鉴定为鳖蠊科昆虫地鳖；地衣芽孢杆菌活菌胶囊(东北制药集团沈阳第一制药有限公司)；复方丹参片(山东仙河药业有限公司)；水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂)；枸橼酸钠；活化部分凝血活酶时间(APTT)测试盒(武汉中太生物技术有限公司)；凝血酶原时间(PT)测试盒(武汉中太生物技术有限公司)；凝血酶时间(TT)测试盒(武汉中太生物技术有限公司)；牛血清蛋白(BSA，国药集团化学试剂有限公司)；福林酚(国药集团化学试剂有限公司)、碳酸钠、酒石酸钾、无水硫酸铜、氢氧化钠皆为分析纯。

1.3 实验仪器

高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；UV9100B型可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)； KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FA1004N型电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；半自动凝血仪(南京瑞迈科技有限公司)。

2 方法

2.1 地衣芽孢杆菌发酵土鳖虫粉的制备

精密称取一定量的土鳖虫干粉，加入活的地衣芽孢杆菌菌粉，并且加少量嗜酸乳酸杆菌来抑制霉菌的生长，用一定的量灭菌水将其稀释成为含2×108个孢子的混悬液，取适量，拌匀润湿，在35～37℃，湿度为40%，在恒温恒湿灭菌培养箱中发酵2天左右，待其表面长满白色的菌丝后停止发酵。

2.2 水溶性活性物质制备

称取未土鳖虫粉、地衣芽孢杆菌发酵土鳖虫粉各100g加20倍量蒸馏水，超声提取10 min，抽滤，倾出滤液，重复上述步骤1次，将2次所得抽滤液混合,3000 r/min，离心，冷冻干燥成粉。

2.3 蛋白质含量的测定[7]

2.3.1 牛血清蛋白标准曲线制备

取六支干燥洁净试管，分别编号，各自精密加入标准溶液0 ,0.2 ,0.4 ,0.6 ,0.8 ,1 mL，添加蒸馏水补充至1 mL，摇匀，立即加入5 mL碱性铜溶液，混匀静置10 min，然后加入0.5 mL福林酚试剂，混匀静置30 min，在可见光下660 nm处测定吸光度。以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，Y=1.7984X+0.0049,R2=0.9983。

2.3.2 样品蛋白质含量的测定

分别精密称取10 mg未发酵土鳖虫和地衣芽孢杆菌发酵土鳖虫水提液冻干粉，用一定量的蒸馏水溶解，定容到10 mL 容量瓶中，取1 mL 溶液，其余步骤同2.3.1"自立即加入5 mL"起 在660 nm 下测定吸光度，带入标准曲线求得浓度，见表1。

2.4 多糖含量的测定[7]

2.4.1 葡萄糖标准曲线的制备

分别精密吸取0 ,1.0 ,2.0 ,3.0 ,4.0 ,5.0 mL葡萄糖标准溶液于10 mL 容量瓶中，加水定容，编号。分别吸取2.0 mL 溶液于具塞试管，精密加入5 %的苯酚溶液1 mL，混匀，迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀，并在40℃下水浴保温15 min，照紫外可见分光光度计490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，Y=1.8557X-0.0158,R2=0.9986。

2.4.2 样品多糖含量的测定

称取未发酵土鳖虫和发酵土鳖虫水提液冻干粉10 mg，加适量的蒸馏水溶解，定容到10 mL 容量瓶中，取2 mL 溶液，其余步骤同2.4.1“自精密加入5%的苯酚溶液1 mL”起 在490 nm 下测定吸光度，带入标准曲线求得浓度，见表1。

2.5 蛋白质与多糖含量

表1 土鳖虫发酵前后活性成分的含量对比

注：土鳖虫发酵前后水溶性活性成分含量比较**P<0.01，*p<0.5

由表1可知土鳖虫蛋白质经地衣芽孢杆菌发酵后，明显减少，这可能是由于蛋白质在发酵的过程中被转化修饰或者被分解为其他小分子物质，如氨基酸。而多糖发酵后的含量与发酵前相比则具有极显著差异，呈现明显增加的趋势，表明了土鳖虫中的某些成分在与地衣芽孢杆菌发生相互作用后可以促进活性物质的产生，如多糖。

2.6 PT、APTT、TT 的测定[8]

取SPF级小鼠 60 只，分为 6 组，每组各10 只，分别为空白对照组(蒸馏水)、丹参对照组、发酵后高剂量组(900 mg/kg)、发酵后中剂量组(450 mg/kg)、发酵后低剂量组(225 mg/kg)，发酵前高剂量组(900 mg/kg)，各组小鼠连续给7 d，每日给药 1 次，给药体积为 1 ml/100g。于最后一次给药 1h 后，用 10% 水合氯醛腹腔麻醉，眼球取血，0.109 mol/L 枸椽酸钠 1:9抗凝，3000 r/min 离心 10 min，取上清液，参照试剂盒操作步骤，应用半自动血液凝固分析仪依次测定 PT、APTT 、TT，见表2。

表2 土鳖虫地芽孢杆菌发酵物抗凝血活性( X±S)

注：**P<0.01，*p<0.5

表2表明，与空白对照组比较，土鳖虫经地衣芽孢杆菌发酵后能显著延长小鼠的 APTT、TT值(P<0.01)，但对PT 值无显著性影响，提示地衣芽孢杆菌发酵物可能是通过抑制内源性系统以及促使血浆纤维蛋白原转变为纤维蛋白而发挥抗凝作用的。

3 讨论

本实验通过测定APTT、PT 和 TT三个指标检测土鳖虫经地衣芽孢杆菌发酵后对抗凝血作用的强度。发酵后低剂量组有一定程度的抗凝血效果，但当增大给药浓度，抗凝作用逐渐增强，与空白对照组比较具有显著性差异。发酵后高剂量组与发酵前高剂量组相比，发酵炮制后的土鳖虫能明显提高抗凝作用。PT主要反映外源性凝血系统的作用，但是在本试验中，土鳖虫发酵后，对PT并无显著的影响，而对APTT、TT则能显著延长其作用时间，表明了土鳖虫发酵炮制后并不是通过阻止外源性凝血系统的途径来抑制凝血过程，从而发挥抗凝作用，但是真正影响抗凝血的机制还需要进一步研究。

[1] 王凤霞. 中华真地鳖(Eupolyphaga sinensis)抗肿瘤蛋白分离纯化及其体外抗转移活性研究[D].济南：山东大学,2013.

[2] 苏永华. 活血化瘀土鳖虫[N].上海中医药报,2013-09-27(004).

[3] 李福彬. 地衣芽孢杆菌的理化特性及对蛋鸡生产性能影响机理的研究[D].保定：河北农业大学,2010.

[4] 王立娜,马明珠,王 颖,等. 中药土鳖虫发酵前后活性成分的含量对比[J].湖南中医杂志,2016,32(8):200-202.

[5] 刘亚明.发酵技术在中医药中的应用[M]. 北京: 中国中医出版社,2010:17.

[6] 冯志华. 产纤溶酶地衣芽孢杆菌与中药红花相辅相成作用的研究[D].成都：四川大学,2004.

[7] 药典委员会. 中华人民共和国药典[四部]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 96.

[8] 王 娜,冯艳风,范会平,等. 大枣粗多糖体外抗凝血活性的差异化研究[J].中国食品学报,2013,13(12):34-39.

(本文文献格式：王立娜，王 颖，朱明珠，等.地衣芽孢杆菌发酵土鳖虫前后水溶性活性物质含量比较及抗凝血活性[J].山东化工，2017，46(10)：102-104.)

The Comparison of Active Ingredients for Fermented and UnfermentedEupolyphaga Sinesis Walker by Bacillus Licheniformis and the Anticoagulant Activity

WangLina,WangYing,ZhuMingzhu,SangXiao,MaoHuixiu,XingBaiying,SunPeng*

(1.College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355, China)

Objective: To compare the protein and polysaccharide content between unfermented and fermented, and to research the anticoagulant activity of Eupolyphaga sinesis Walke after fermentation of Bacillus licheniformis; Methods: By using the improved Lowry method and sulfuric acid method to deteimine the content of protein and phenol.To investigate the role of anticoagulant activity about the prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT) the prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT). Results: The Eupolyphaga sinesis Walker before fermentation of water soluble protein content was 65.2061 mg/g, 55.9015 mg/g after fermentation, the polysaccharide content before fermentation was 46.9724 mg/g. After fermentation was 84.8736 mg/g; And The Eupolyphaga sinesis Walker after fermentation of Bacillus licheniformis could significantly prolong the mice of APTT, TT, but had no obvious effect on PT. Conclusion: The Eupolyphaga sinesis Walker after fermentation of Bacillus licheniformis can obviously increase the content of polysaccharide and significantly decrease the content of protein. And it has stronger anticoagulant effect after fermentation.

bacillus licheniformis;eupolyphaga sinesis walker; aactive ingredients; anticoagulant

2017-03-27

2016年国家级大学生创新创业训练计划项目(项目编号：201610441045);山东中医药大学大学生研究训练(SRT)计划资助项目(项目编号：2016052)

王立娜，女，研究方向制药工程;通信作者：孙 鹏，研究方向 ：中药活性成分与活性评价。

R284.1

A

1008-021X(2017)10-0102-03