响应面法优化萎缩芽孢杆菌BsR05发酵培养基

戴宝,扈进冬，尹姗姗，李纪顺*，魏艳丽

(1.山东泰诺药业有限公司，山东 诸城262200； 2.山东省科学院生态研究所，山东 济南250014； 3.山东省植物保护总站，山东 济南250100)

响应面法优化萎缩芽孢杆菌BsR05发酵培养基

戴宝1,扈进冬2，尹姗姗3，李纪顺2*，魏艳丽2

(1.山东泰诺药业有限公司，山东 诸城262200； 2.山东省科学院生态研究所，山东 济南250014； 3.山东省植物保护总站，山东 济南250100)

为了提高萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus BsR05发酵液的芽孢产量，采用响应面法对BsR05发酵培养基的最佳工艺条件进行了优化。通过Plackett-Burman 实验，筛选出玉米粉、(NH4)2SO4和MgSO4·7H2O为影响产孢的主要因子。采用最陡爬坡路径法确定3个因素的响应中心点及最适浓度范围，最后，通过Box-Behnken设计建立主要培养基成分与芽孢产量之间的回归关系，并确定发酵培养基最佳配方为葡萄糖5 g/L、玉米粉15.9 g/L、豆粕40.0 g/L、K2HPO43.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、(NH4)2SO42.1 g/L、MgSO4·7H2O 0.40 g/L、MnSO40.02 g/L。经重复实验验证，平均芽孢含量与预测芽孢含量基本一致，发酵液中BsR05的芽孢产量从优化前的4.73×109CFU/mL 提高到6.02×109CFU/mL。

萎缩芽孢杆菌；培养基优化；响应面分析

随着国家对生态环境、农业可持续发展的重视，人们也更加注重食品安全。目前，农产品的出口以及食品贸易中农药残留的标准正逐步提高[1]，国家也相继出台实施化学农药零增长、加速生物农药发展的政策，作为新型农药代表的生物农药产业将具有广阔的发展前景。芽孢杆菌类杀菌剂由于其可以产生抗逆的芽孢，并且生防功能多样，已经成为我国微生物农药的主要类型之一[2-6]。截止2016年4月，农业部登记的生物农药中，各种芽孢杆菌类杀菌剂有101个。在产品的开发过程中菌株是根本，发酵工艺是关键。然而，由于我国生物农药研发单位和生产企业的发酵工艺及制剂研究技术力量还比较薄弱，造成了发酵成本偏高，从而导致产品成本高。与此同时，生物农药的制剂剂型单一、防治效果不理想等问题，影响了其在农业生产中的应用推广[7]。

萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)是芽孢杆菌属的一个重要种，国内也称枯草芽孢黑色变种[8]，可以产生耐受不良环境的孢子，能在80 ℃以上的温度生长，抗性强，无致病性，在农业上已发现其对小麦全蚀病、棉铃疫病、赤霉病等多种植物病害具有良好的防治效果[9]。菌株BsR05是本实验室从保护地蔬菜土壤中分离筛选到的一株生防菌，经鉴定为萎缩芽孢杆菌，该菌株对灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、串珠镰刀菌(FusariummoniliformeSheld)、链格孢(Alternariaalternata)等多种植物病原真菌具有明显的抑制作用，在温室盆栽试验中对防治黄瓜灰霉病效果显著，具有较高的应用潜能和研究价值。为了进一步降低发酵成本，本研究采用Plackett-Burman设计、最陡爬坡路径法及响应面试验设计法对BsR05发酵培养基配方进行优化，期望获得液体深层发酵培养高产孢量的发酵培养基配方，实现该菌株在企业中大规模化生产及商业化应用。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

萎缩芽孢杆菌BsR05菌株，由山东省科学院生物研究所应用微生物实验室分离和保存。玉米粉、豆粕为市售，过80目筛备用。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 培养基

1.3 方法

1.3.1 发酵培养条件

采用500 mL三角瓶装入50 mL液体发酵培养基，按照体积分数5%接种量接入种子发酵液(培养条件)，在32 ℃，180 r/min 的振荡培养箱中振荡培养48 h后测定发酵液中芽孢含量。

1.3.2 培养基的优化

依据Minitab16 软件的Plackett-Burman实验设计，筛选出BsR05发酵培养基中影响芽孢产量的主要因素，然后，应用最陡爬坡路径法确定主要因素的响应中心点及最适浓度范围，最后通过Box-Behnken设计和响应面分析确定最佳培养基配方。

1.3.2.1 Plackett-Burman 设计法

经勘测，闸底（即堰顶）高程为2.69 m，与现今温瑞塘河通常水位2.62 m接近。温州地处滨海，地势西高东低，河流源短流急，降水后河道水位迅速升高，并经常受潮水顶托，造成城市内涝。古时汛期，台风或暴雨来临前，闸工根据气象情况，将水闸全部打开对河水进行预排，腾空温瑞塘河库容，调蓄洪水，防止发生内涝。由此可见，闸底（即堰顶）高程即为汛限水位，用以指导汛期防洪调度。

选取初始发酵培养基中的各个组分，采用Minitab16 软件的Plackett-Burman 设计筛选发酵培养基中影响芽孢产量的主要因素。选择8 因子2 水平的实验设计，每个因素取高低两个水平(表1)。全面考察初始发酵培养基中8个组分对芽孢产量的影响。

表1 Plackett-Burman实验设计因子和水平

Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman 单位：g/L

变量符号水平-11A葡萄糖510B玉米粉2030C豆粕粉4060 D(NH4)2SO424EKH2PO411．5FK2HPO434 GMgSO4·7H2O0．20．3HMnSO40．020．03

1.3.2.2 最陡爬坡路径法

根据Plackett-Burman实验得出的一次拟合方程，确定因素取值的中心点。并根据拟合方程中各变量的系数确定主要因素的爬坡方向和变化步长，发酵培养基中除去主要因素之外的其他组分和初始培养基一致。然后，根据爬坡实验中发酵液芽孢量的变化趋势，确定Box-Behnken实验设计的中心点及最适质量浓度范围。

1.3.2.3 响应面分析

根据最陡爬坡实验结果，确定Plackett-Burman 实验主要因素的最适质量浓度范围。采用Minitab16 软件中Box-Behnken设计3 因素优化实验，响应面分析各因素之间的相互作用。

1.3.2.4 验证实验

采用确定的最佳优化培养基进行3 次重复发酵实验，取3次实验结果的平均值与预测值比较，验证模型的可靠性，确定最终的优化发酵培养基配方。

1.3.3 芽孢含量测定

取发酵液1 mL于1.5 mL无菌离心管中，在80 ℃水浴锅中水浴处理15 min，采用稀释涂布法计数芽孢生长数[10]。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman实验结果分析

Plackett-Burman实验设计和结果见表2。Plackett-Burman 设计的各因素水平及效应评价见表3，根据实验设计的回归分析结果的P值可以确定对发酵液芽孢含量具有显著影响的因子由大到小依次是玉米粉、MgSO4·7H2O 和(NH4)2SO4，从而确定这3 个因子作为下一步实验的关键因素。

表2 Plackett-Burman实验设计和结果

续表2

序号ABCDEFGHY/(109CFU·mL-1)6-11-1-1-11113．8271-111-11-1-13．308-1-1111-1113．949111-111-113．121011-111-11-13．5211-1-1-1-1-1-1-1-14．08121-11-1-1-1114．54

Plackett-Burman实验设计的回归分析结果(表3)表明，R-Sq(调整)为93.5%，说明一次拟合方程拟合良好，可以反映实际实验情况。玉米粉(B)、(NH4)2SO4(D)和MgSO4·7H2O(G)的可信度水平均高于95%(P<0.05)，因此被视为对发酵芽孢数有显著影响的因素。而其他5个因素的可信度水平均低于95%(P>0.05)，则认为对发酵芽孢数无显著影响。

表3 Plaekett-Burman实验设计的回归分析结果

注：S = 0.172 568， R-Sq= 98.2% ， R-Sq(调整) = 93.5%。

根据Plackett-Burman实验结果确定玉米粉、(NH4)2SO4和MgSO4·7H2O是影响萎缩芽孢杆菌BsR05发酵液芽孢产量的主要因素，其中MgSO4·7H2O是正效应因子，在设计最陡爬坡实验时，浓度依次增加；玉米粉和(NH4)2SO4是负效应因子，浓度依次降低。最终确定3种主要因素进行最陡爬坡路径实验的最适浓度范围和结果见表4。BsR05发酵液中芽孢含量随MgSO4·7H2O、玉米粉和(NH4)2SO4浓度的变化先上升后下降。在MgSO4·7H2O 0.4 g/L、(NH4)2SO42 g/L、玉米粉 15 g/L 时，BsR05发酵液中芽孢含量最高，选择此点作为响应中心点，进行进一步的响应面分析。

表4 最陡爬坡路径实验设计和结果

2.2 响应面设计结果分析

依据Minitab16 软件的Box-Behnken 设计进行3因素3水平实验设计，各因素编码水平见表5。每个处理重复3次，Box-Behnken实验设计和结果见表6。用Minitab16软件对设计实验进行方差分析并对实验结果进行二次回归拟合，结果如表7。

表5 Box-Behnken设计编码水平表

表6 Box-Behnken设计和结果

表7 Box-Behnken实验设计回归分析结果

注：S= 0.215 438 ，R-Sq=98.6% ，R-Sq(调整) =96.5%。

利用Minitab16.0回归拟合实验数据，获得芽孢产量对发酵参数的三元二次回归方程:

Y=(6.03)-0.265X1+0.0.175X2+0.07X3-0.697X12-0.717X22-0.867X32-0.190X1X2+0.025X1X3+0.015X2X3。

该模型的决定系数R-Sq(调整)为96.5%，表明该回归方程的拟合程度较好，实验误差小，能较好地反映3种主要因素与芽孢产量之间的关系，因此，可以用于BsR05发酵液中芽孢产量的分析和预测。采用Minitab软件绘制响应面图，如图1所示。

A 固定水平：(NH4)2SO4 2 g/L;B 固定水平：玉米粉 15 g/L;C 固定水平：MgSO4·7H2O 0.4 g/L。图1 3种主要因素交互作用对BsR05发酵产孢影响的响应面图Fig.1 Response surface plot for the interaction effects of 3 major factors on sporulation of BsR05 fermentation

Minitab16回归拟合方程及响应面图表明，当(NH4)2SO4浓度不变时，产孢量随着玉米粉和MgSO4·7H2O浓度的升高呈现先升高后降低的趋势，并且MgSO4·7H2O变化幅度较玉米粉大，主要原因是MgSO4·7H2O在特定浓度下可以加速产孢；当玉米粉浓度不变时，产孢量随 (NH4)2SO4浓度的升高呈缓慢增加趋势，伴随MgSO4·7H2O浓度的升高产孢量增加速度较快，且呈现先升高后降低的趋势；当MgSO4·7H2O浓度不变时，产孢量随着玉米粉和(NH4)2SO4浓度的升高同样呈现先增大后降低的趋势，但变化幅度略微平缓。此外，根据响应面图分析，可以发现在较高浓度下的玉米粉、(NH4)2SO4和MgSO4·7H2O不利于BsR05发酵产孢。

2.3 验证实验结果分析

采用Minitab16 软件中的响应优化器可以获得上述3种主要因素的最优值点为玉米粉15.86 g/L、(NH4)2SO42.09 g/L和MgSO4·7H2O 0.405 g/L，在发酵条件下预测的发酵产芽孢的最大数为6.08×109CFU/mL。在该发酵条件3次重复验证实验结果分别为5.87×109CFU/mL、6.15×109CFU/mL和6.02×109CFU/mL，平均值为(6.02±0.09)×109CFU/mL，与预测值 6.08×109CFU/mL基本一致，实验数值和预测值拟合性高，说明建立的模型是有效的。最后确定经响应面优化后BsR05菌株的发酵培养基配方为：葡萄糖5 g/L，玉米粉15.9 g/L，豆粕40.0 g/L，K2HPO43.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，(NH4)2SO42.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.40 g/L,MnSO40.02 g/L，水1 000 mL。

3 讨论

发酵培养基的优化是微生物杀菌剂实现工业化生产的重要环节。Plackett-Burman设计法可以快速、有效地从大量的影响因素中筛选出其中的关键因素[11]，已成为微生物发酵培养基优化过程中显著因子筛选的通用方法之一。在此基础上使用响应面分析法可以进一步分析、筛选并获得多个显著因子之间交互作用的影响，可以同时优化影响响应值的多个变量。与其他优化方法相比，响应面法可以减少实验次数、用时更短，同时还可获得多元二次回归方程以精确预测最终产量，结果可靠，常被用于微生物发酵培养基及发酵过程的条件优化。如张丹等[12]利用响应面法对一株产蛋白酶菌株进行发酵条件优化，优化后该蛋白酶酶活力最大值为2504.8 U，酶活力较优化前提高了4倍。刘京兰等[13]采用响应面法对生防解淀粉芽孢杆菌CC09发酵产iturin A进行了优化，优化后生防解淀粉芽孢杆菌CC09合成iturin A的产量达501 mg/L，较优化前提高了4.2倍，且发酵成本是利用改良LB培养基的4.3%。李悦等[14]在单因素实验的基础上，利用Plackett-Burman实验分析及响应面法对纤维素酶高产菌小刺青霉(Penicilliumspinulosum)16-7进行发酵工艺条件的优化，优化后菌株产内切纤维素酶活(CMCase activity)为387.58 U、滤纸酶活(filter paper activity)为128.86 U，比优化前提高49.07 %。李雯静等[15]采用响应面法对一株羊源丁酸梭菌的发酵工艺进行了优化，优化后芽胞数为1.478×108CFU/mL，是优化前的2.7 倍。上述例证均表明，响应面分析法是一种科学、有效的优化分析方法。

芽孢杆菌是一种重要的生防因子，可以定殖于寄主植物根、茎、叶部位，从而与病原菌竞争营养和侵染位点；有些芽孢杆菌还可以分泌抗菌物质、抑制病原菌生长；可以诱导植物抗病性、抵御植物病原菌侵害，从而有效地防治植物病害。而且，由于芽孢杆菌能够产生抗逆的芽孢的抵御不良环境的影响，是一类理想的生防菌[16]。微生物菌剂中的活菌数是保证产品效果的重要指标，活菌数量降低通常会影响生防制剂的使用效果，造成微生物杀菌剂在使用过程中防治效果不稳定。芽孢杆菌产生的芽孢是一种抗逆休眠体，能够有效地抵御不良环境影响，从而保证产品中活菌含量，提高产品保存期。因此，以芽孢产量为指标优化BsR05的发酵培养基在生产上更具有实际意义，为其工业化发酵高产芽孢工艺奠定了基础。该发酵参数在中试和工业化的实际发酵过程中，还有待于进一步的验证。

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Optimization of fermentation medium composition forBacillusatrophaeusBsR05 by response surface method

DAI Bao1, HU Jin-dong2, YIN Shan-shan3, LI Ji-shun2*, WEI Yan-li2

(1. Shandong Tenov Pesticides Co.Ltd., Zhucheng 262200, China; 2.Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China; 3. Plant Protection Station of Shandong Province, Jinan 250100, China)

∶To increase the spore production ofBacillusatrophaeusBsR05, a response surface method was applied to optimize the technological conditions of BsR05 fermentation medium. Corn flour, (NH4)2SO4and MgSO4·7H2O were selected as the major factors affecting sporulation by means of Plackett-Burman design. The method of steepest ascent path was adopted to determine the response center and the optimal concentration range of these 3 factors. Finally, the regression relationship between the main medium composition and the spore yield was established by Box-Behnken design. The optimal formula for the fermentation medium was determined as follow：glucose 5 g/L，corn flour 15.9 g/L, soybean meal 40 g/L, K2HPO43.0 g/L, KH2PO41.0 g/L, (NH4)2SO42.1 g/L, MgSO4·7H2O 0.40 g/L and MnSO40.020 g/L. After repeated experiments, it was verified that the average spore content was basically consistent with the predicted spore content, and the concentration of the spore was increased from 4.73×109CFU/mL to 6.02×109CFU/mL after the optimization.

∶Bacillus atrophaeus；medium optimization；eesponse surface methodology

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.006

2016-10-02

山东省2015年度农业重大应用技术创新项目;山东省科学院-枣庄市产业技术研发联合基金(201510)

戴宝(1964—)男，研究方向为生物肥料和生物农药。

*通信作者，李纪顺(1970—)，男，高级工程师，研究方向为生物肥料和生物农药。E-mail：yewu2@sdas.org

S476

A

1002-4026(2017)04-0031-07