基于原子力显微镜研究p53蛋白与PBR322 DNA的相互作用

陈洋，王艳伟，杨光参

(温州大学物理与电子信息工程学院，浙江 温州 325035)

基于原子力显微镜研究p53蛋白与PBR322 DNA的相互作用

陈洋，王艳伟，杨光参*

(温州大学物理与电子信息工程学院，浙江 温州 325035)

肿瘤(癌症)是由于细胞在复制过程中，DNA损伤不能修复导致细胞凋亡或者细胞无限增殖而形成的。DNA在细胞中转录和翻译都会涉及蛋白与DNA的结合，肿瘤抑制蛋白也是参与这一过程的关键蛋白之一。然而，众多研究发现，肿瘤抑制蛋白p53具有识别和修复损伤DNA的效果，对于细胞的凋亡、基因的保护和避免癌症发生有着重要的意义。有研究表明，金属镁离子和锌离子可以增强p53蛋白的结构稳定性和p53-DNA的亲和力。因此，我们基于原子力显微镜(AFM)，直观地呈现出p53蛋白与PBR322环状DNA相互作用的图像，同时发现p53蛋白可以使环状DNA自身形成聚集或者相交。但是，对于长度相当的5 000bp的线状DNA几乎没有这样的效果，而对于20 000bp DNA不会出现这样的现象。然而，在高浓度镁离子环境下，环状DNA会扭转成为麻花状，即形成超螺旋结构。这一现象，可为p53蛋白功能和作用机理研究提供指导，也为癌症治疗、癌症药物开发以及癌症检测方法提供启发。

p53蛋白；金属镁离子；PBR322环状DNA；相互作用；DNA超螺旋

目前来说，肿瘤依然难以攻克。肿瘤(癌症)是由于细胞在复制过程中，DNA损伤不能修复导致的细胞无限增殖或者细胞凋亡而形成的[1-6]。众多研究发现，在人类恶性肿瘤疾病中，肿瘤细胞中的p53基因至少有50%发生了突变[7]。但是，p53蛋白具有识别和修复损伤DNA的效果，从而达到抑癌作用。因此，p53蛋白也叫肿瘤抑制蛋白，是参与细胞复制的关键蛋白之一，对于细胞的凋亡、基因的保护和避免癌症发生有着重要的意义[8-9]。

现在，众多研究者对于p53蛋白的结构都有一致的认识，认为p53蛋白是由393个残基构成的多域蛋白。这个多域蛋白可分为五部分，分别为：(1)N端域(N-terminal domain，N-ter)-末端转录活化区，能与一系列的蛋白结构结合，调节p53的转录功能[10-14]和其与DNA的解离[15]；(2)信号区，富含脯氨酸，有5个脯-X-X-脯重复顺序，此区不是转录活化区所必须的，但对诱导细胞凋亡是必须的；(3)DNA特异性结合域(DNA binding domain，DBD)，也叫核心域(core domain)，可以特异性结合到DNA[16]；(4)四聚化域(tetramerization domain，Tet)；(5)C端域(C-terminal domain，C-ter)部分与DNA 非特异性结合[1，7，17]。学者们对于p53-DNA相互作用也提出了两个滑动搜索机制：(1)一维滑动模式。p53蛋白持续与DNA保持接触形式，沿着DNA滑动扩散[18-22]。(2)“Hopping”模式和“Jumping”模式。Hopping模式，是p53蛋白在一条DNA上跳跃行走。Jumping模式，是p53蛋白从一条DNA上跳跃到另外一条DNA上，这种情况很少发生[23-24]。一直以来，大家关注最多的是p53蛋白在DNA上的滑动机制。然而，p53蛋白与DNA相互作用的机制还没有完全被搞清楚。可以通过p53蛋白与DNA相互作用的结果推演其作用机制，为完善此作用机制提供可能和方向。

金属离子对于p53-DNA相互作用也有一定影响。比如一些有毒的离子(如汞、镉、铜等)可以结合到p53蛋白，破坏p53蛋白的结构和p53蛋白与DNA的亲和力。再比如镁和锌离子等可以增强p53蛋白的结构和p53蛋白与DNA的亲和力[25-26]。

在本文中，我们基于AFM扫描p53蛋白与PBR322 DNA相互作用的图像，直观地展现了p53与环状DNA的相互作用结果。研究发现，p53蛋白可以使环状DNA自身形成聚集或者相交。而对于5 000bp DNA的效果很不明显，对于20 000bp DNA则没有这样的现象。此外，也发现在高浓度镁离子环境下，环状DNA会扭转成为麻花状，即形成超螺旋结构。这一现象，可以为p53蛋白功能和作用机理研究提供启示，也希望为癌症治疗、癌症药物开发以及癌症检测方法提供启示。

1 实验材料及方法

1.1 实验材料和样品制备

1.1.1 人类全长p53蛋白和PBR322 DNA以及相关材料

实验使用的人类全长p53蛋白购自美国Sigama-Aldrich公司，其母液浓度为200 ～ 600 ng/μL。P53蛋白母液包含50 mmol/L磷酸钠和50 mmol/L氯化钠，pH为7.5。P53蛋白的重组与表达都是通过大肠杆菌生产，并且通过SDS-PAGE方式检测得知，其纯度至少达到90%。实验使用的PBR322 DNA(4 000bp，环状)/5 000bp DNA/20 000bp DNA(NoLimits，Fermentas/Thermo Fisher Scientific， Burlinton， Ontario ，Canada)购自美国Thermo Fisher Scientific公司，直接使用，没有经过再次纯化处理，其出厂时的母液浓度为500 ng/μL。溶液环境为1×TE 缓冲液，此缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl和1 mmol/L EDTA组成，pH为7.6。配制缓冲液使用的去离子水是Milli-Q系统(美国Millipore公司生产)制备的，其中水的电导率小于1×10-6Ω-1cm-1。云母片被切成1.0 ～ 1.5 cm2正方形，在使用时即撕即用。其他实验用药品(比如Tris、氯化镁等)均购自美国Sigma-Aldrich公司。

缓冲液pH是通过添加盐酸调节到7.5的状态，其pH的测量使用的是Sartorius Basic pH Meter PB-10。

1.1.2 AFM样品制备

DNA对照组样品的制备。DNA对照组中药品是用500 ng/μL的DNA母液在5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2溶液(pH为7.5)中培育得到的。通常地，加入二价阳离子是用来将带负电的DNA吸附到带负电的云母片上[27- 28]。在此，镁离子不仅起到吸附作用，而且也是研究对象之一。取0.4 μL DNA母液与119.6 μL 5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH为7.5)缓冲液混合，形成DNA浓度为1 ng/μL的溶液200 μL，然后，充分混合均匀，再冰浴30 min。之后，取30 μL的DNA对照组溶液滴到刚撕好的云母片(1 cm×1 cm)上，沉积3 min，使DNA粘附到云母片上。然后用50 μL的去离子水轻轻冲洗15次左右，以便冲去多余的杂质分子。再用氮气轻轻地吹干，之后用AFM扫描成像。如图1所示。

图1 AFM样品制备流程图Fig.1 Flow chart of AFM sample preparation

P53-DNA复合物对照组样品制备，操作方法与DNA对照组样品制备一致，只是p53蛋白与DNA的配比不同。把p53蛋白和DNA浓度配比调制为2∶1，即p53蛋白浓度为2 ng/μL，DNA浓度为1 ng/μL。

1.2 实验仪器、方法和数据处理

实验时使用的AFM是购自德国JPK公司的NanoWizardⅢ AFM，配置有一个NanoWizard AFM 自动机器人和一台控制器，还有控温系统BioScience和NanoScience系统。使用的探针是NanoWorld公司生产的NCHR-50型探针，其详细参数为：悬臂长为125 μm，宽度为30 μm ，厚度为4 μm ，弹性系数为42 N/m，共振频率为320 kHz，硅质镀铝。将制作好的样品，放置在AFM操作台上，在常温下的空气中用AC mode(即轻敲模式、非接触模式)模式扫描样品。扫描尺寸为1.5 μm × 1.5 μm，扫描线率为1.0 Hz。对于每一个样品，都选取不同的区域进行扫描，这样可以减小溶液不均匀带来的误差。

得到的每张图的像素为512×512。使用4.2版本的JPK Data Processing软件对原图进行相应且一致的处理，使用Image J软件对图像排版和编辑。

2 实验结果与讨论

2.1 p53蛋白与PBR322 DNA的AFM成像结果

使用AFM扫描得到Tris缓冲液培育的PBR322 DNA图像，发现这些DNA形貌保持一致。如图2a对照组PBR322 DNA AFM图像，PBR322 DNA形貌都呈现自由舒展状态。其中，溶液环境为5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH为7.5)，PBR322 DNA浓度为1 ng/μL。有时由于去离子水的冲洗，留存在云母片上的DNA形貌有些改变，但是，所有图像中DNA呈现的形貌基本保持自由舒展状态，这是因为DNA本身带负电导致的[28-29]。

图2b为p53-PBR322 DNA聚合物的AFM图像。其中，溶液环境为5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH为7.5)，p53浓度为2 ng/μL，PBR322 DNA浓度为1 ng/μL。可以明显看到PBR322 DNA由于p53蛋白粘附于环上的两个点，致使PBR322 DNA出现两个环或者更多环的现象，其自身交点增多，甚至有的直接聚集为棒状。出现这样的现象，是由于p53蛋白与DNA的静电相互作用导致的。这也许是聚集的p53蛋白各自的C端分别粘附同一条DNA的不同位置所致。

众所周知，二价镁离子不能使DNA发生凝聚[30]。Liu等[31]的研究表明金属离子可以增强组蛋白与DNA的自组装现象。在他们的实验中，金属镁离子具有增强组蛋白和DNA自组装的作用；钙离子却具有不一样的效果。在我们的实验中，金属镁离子也呈现了同样的效果。我们把缓冲液中镁离子的浓度变为20 mmol/L，即缓冲液为5 mmol/L Tris 20 mmol/L MgCl2(pH为7.5)，用AFM扫描此缓冲液条件下培育的p53蛋白与PBR322 DNA混合物。培育混合物时，p53蛋白浓度为2 ng/μL，PBR322 DNA浓度为1 ng/μL。我们发现PBR322环状DNA上的结点会更多，甚至出现麻花状扭转(如图2c所示)。这样的现象表明，高浓度的镁离子可以促进p53蛋白与DNA凝聚现象，这也许是由于高浓度镁离子增强了p53蛋白与DNA的亲和力所致。

图2 p53蛋白与PBR322 DNA AFM图像(高度图，1.5 μm ×1.5 μm)。Fig.2 AFM images of PBR322 DNA and p53 protein (Height images, 1.5 μm×1.5 μm).

2.2 p53蛋白与5 000bp和20 000bp DNA的AFM成像结果

使用AFM扫描Tris缓冲液分别培育的5 000bp DNA和20 000bp DNA，在AFM图像中这些DNA形貌基本一致，都呈现自由舒展状态(如图3a、c所示)。其中，溶液环境为5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH为7.5)，DNA浓度为1 ng/μL。但是，对于5 000bp DNA来说，自身很少出现环状或者交叉现象；对于20 000bp DNA，自身却很容易出现交叉或叠加，进而呈现出环状。这是由于20 000bp DNA比较长，自身重力比静电相互作用力更强，从而导致交叉或叠加现象。而5 000bp DNA长度比较短，静电相互作用起主导作用。

如图3b、d所示，可以清晰看到5 000bp DNA和20 000bp DNA上都粘附有p53蛋白。其中，溶液环境为5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH为7.5)，p53浓度为2 ng/μL，DNA浓度为1 ng/μL。图3b中，p53蛋白多同时结合两条DNA，很少出现一条DNA呈环状的情况。甚少有区别于图3a中的成环现象。也就是说，p53蛋白可以使5 000bp DNA成环或者交叉出现，但是效果很不明显。

从图3c、d中，可以明显看到20 000bp DNA的形貌没有变化，成环和交叉现象一致。主要区别在于图3d中DNA上有p53蛋白，而图3c中的DNA上没有。因此，我们认为p53蛋白不能诱使较长的链状DNA成环或者交叉。

图3 p53蛋白与5 000bp DNA和20 000bp DNA的AFM图像(高度图，1.5 μm ×1.5 μm)。 Fig.3 AFM images of p53 protein and 5 000bp DNA/20 000bp DNA (Height images, 1.5 μm×1.5 μm).

3 结论

在p53蛋白与PBR322 DNA相互作用的AFM图像中，可以直观地看到p53与环状DNA的相互作用结果。在镁离子浓度为3 mmol/L，并且没有p53蛋白时，可以很直观地看到PBR322环状DNA都呈现自由的环状，基本没有相交现象出现。当加入p53蛋白时，环状DNA自身形成聚集或者相交，即环状DNA自身出现更多的环，有的甚至呈现棒状。对于5 000bp DNA有类似效果，却很不明显，对于20 000bp DNA没有这样的现象。但是，在高浓度(20 mmol/L)镁离子环境下，环状DNA会扭转成为麻花状，甚至出现超螺旋。我们认为，这一现象的出现有两方面的原因：一个是p53蛋白与DNA间相互静电的作用，另一个是高浓度镁离子增强了p53蛋白与DNA之间的亲和力。镁离子可以与p53残基结合，增强结构稳定性，并且可以增加残基电荷量，使其可以与带负电的DNA有更强的静电相互作用力[25-26]。

[1]NUTTALL P, LEE K, CICCARELLA P, et al. Single-molecule studies of unlabeled full-length p53 protein binding to DNA[J]. Journal of Physical Chemistry B, 2016, 120(9)：2106-2114.

[2] FUNK W D, PAK D T, KARAS R H, et al. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes[J]. Molecular & Cellular Biology, 1992, 12(6): 2866-2871.

[3] TOKINO T, THIAGALINGAM S, ELDEIRY W S, et al. p53 tagged sites from human genomic DNA[J]. Human Molecular Genetics, 1994, 3(9): 1537-1542.

[4] JIAO Y, CHERNY D I, HEIM G, et al. Dynamic interactions of p53 with DNA in solution by time-lapse atomic force microscopy[J]. Journal of Molecular Biology, 2001, 314(2): 233-243.

[5] VOGELSTEIN B, LANE D P, LEVINE A J. Surfing the TP53 network[J]. Nature, 2000, 408(6810): 307-310.

[6] BROWN C J, LAIN S, VERMA C S, et al. Awakening guardian angels: Drugging the p53 pathway[J]. Nature Reviews Cancer, 2009, 9(12): 862-73.

[7] LEVINE A J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division[J]. Cell, 1997, 88(3): 323-331.

[8] HOLLSTEIN M, RICE K, GREENBLATT M S, et al. Database of p53 gene somatic mutations in human tumors and cell lines[J]. Nucleic Acids Research, 1994, 22(17): 3551-5.

[9] HOLLSTEIN M, SHOMER B, GREENBLATT M, et al. Somatic point mutations in the p53 gene of human tumors and cell lines: updated compilation[J]. Nucleic Acids Research, 1996, 24(1): 141-6.

[10] NAGAICH A K, ZHURKIN V B, SAKAMOTO H, et al. Architectural accommodation in the complex of four p53 DNA binding domain peptides with the p21/waf1/cip1 DNA response element[J]. The Journal of biological chemistry, 1997, 272(23): 14830-41.

[11] WANG Y, REED M, WANG P, et al. p53 domains: identification and characterization of two autonomous DNA-binding regions[J]. Genes & Development, 1993, 7(12B): 2575.

[12] WANG Y, SCHWEDES J F, PARKS D, et al. Interaction of p53 with its consensus DNA-binding site[J]. Molecular & Cellular Biology, 1995, 15(4): 2157-2165.

[13] BALAGURUMOORTHY P, SAKAMOTO H, LEWIS M S, et al. Four p53 DNA-binding domain peptides bind natural p53-response elements and bend the DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1995, 92(19): 8591-5.

[14] CHERNY D I, STRIKER G, SUBRAMANIAM V, et al. DNA bending due to specific p53 and p53 core domain-DNA interactions visualized by electron microscopy[J]. Journal of Molecular Biology, 1999, 294(4): 1015-1026.

[15] CAIN C, MILLER S, AHN J, et al. The N terminus of p53 regulates its dissociation from DNA[J]. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(51): 39944-39953.

[16] BARGONETTI J, MANFREDI J J, CHEN X, et al. A proteolytic fragment from the central region of p53 has marked sequence-specific DNA-binding activity when generated from wild-type but not from oncogenic mutant p53 protein[J]. Genes & Development, 1993, 7(12B): 2565.

[17] BAKALKIN G, SELIVANOVA G, YAKOVLEVA T, et al. p53 binds single-stranded DNA ends through the C-terminal domain and internal DNA segments via the middle domain[J]. Nucleic Acids Research, 1995, 23(3): 362-369.

[18] RICHTER P H, EIGEN M. Diffusion controlled reaction rates in spheroidal geometry. Application to repressor-operator association and membrane bound enzymes[J]. Biophysical Chemistry, 1974, 2(2): 255-263.

[19] BERG O G, BLOMBERG C. Association kinetics with coupled diffusional flows. Special application to the lac repressor-operator system[J]. Biophysical Chemistry, 1976, 4(4): 367-381.

[20] BERG O G, BLOMBERG C. Association kinetics with coupled diffusion. An extension to coiled-chain macromolecules applied to the lac repressor-operator system[J]. Biophysical Chemistry, 1977, 7(1): 33.

[21] BERG O G, BLOMBERG C. Association kinetics with coupled diffusion : III. Ionic-strength dependence of the lac repressor-operator association[J]. Biophysical Chemistry, 1978, 8(4): 271-280.

[22] WINTER R B, VON HIPPEL P H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 2. The Escherichia coli lac repressor-operator interaction: equilibrium measurements[J]. Biochemistry, 1981, 20(24): 6948-6960.

[23] 张先恩. 生物结构自组装[J]. 科学通报, 2009, (18): 2682-2690.

[24] OIJEN A M V. A single-molecule characterization of P53 search on DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(2): 563-568.

[25] XUE Y, WANG S, FENG X. Influence of magnesium ion on the binding of p53 DNA-binding domain to DNA-response elements[J]. Journal of Biochemistry, 2009, 146(1): 77-85.

[26] XUE Y, WANG S X. Effect of metal ion on the structural stability of tumour suppressor protein p53 DNA-binding domain[J]. Journal of Biochemistry, 2009, 146(2): 193-200.

[27] CASSINA V, SERUGGIA D, BERETTA G L, et al. Atomic force microscopy study of DNA conformation in the presence of drugs[J]. Biophysics of Structure & Mechanism, 2011, 40(1): 59-68.

[28] LIU Z, LI Z, ZHOU H, et al. Imaging DNA molecules on mica surface by atomic force microscopy in air and in liquid[J]. Microscopy Research & Technique, 2005, 66(4): 179-185.

[29] THUNDAT T, ALLISON D P, WARMACK R J. Stretched DNA structures observed with atomic force microscopy[J]. Nucleic Acids Research, 1994, 22(20): 4224-8.

[30] TAFVIZI A, HUANG F, LEITH J S, et al. Tumor suppressor p53 slides on DNA with low friction and high stability[J]. Biophysical Journal, 2008, 95(1): L01-L03.

[31] LIU Y, GUTHOLD M, SNYDER M J, et al. AFM of self-assembled lambda DNA-histone networks[J]. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2015, 134: 17-25.

Study on interaction between p53 protein and PBR322 DNA based on atomic force microscopy

CHEN Yang, WANG Yan-wei, YANG Guang-can*

(School of Physics and Electronic Information, Wenzhou University, Wenzhou, 325035, China)

∶Tumor (cancer) is caused by the apoptosis or proliferation of cells when DNA damage cannot be repaired in time in the process of replication. The processes of DNA transcription and expression are all involved in the interaction of protein and DNA in living cells. And, tumor suppressor protein is also one of the key proteins involved in this process. However, many studies have found that the tumor suppressor protein p53 can recognize and repair damaging-DNA, which plays a significant role in cell apoptosis, gene protection and avoidance of cancer. Studies have shown that the structural stability of p53 protein and the affinity of p53-DNA can be enhanced by metal ions, such as magnesium and zinc ions. Therefore, based on atomic force microscopy (AFM), the interaction image of p53 protein and PBR322 ring DNA is visually presented. And, it is found that p53 protein can promote a ring DNA aggregation or cross in itself. However, this phenomenon occurrence is rare for linear DNA with the length of 5 000bp, and it is not occurrence in 20 000bp DNA either. However, protein p53 can make ring DNA to be a twist shape in high magnesium concentration solution, that is, the supercoil shape is formed. This phenomenon may provide guidance for the study on the function and mechanism of protein p53, as well as provide insights into cancer therapy, cancer drug development and cancer detection methods.

∶ protein p53；metal magnesium ions；PBR322 ring DNA；interaction；DNA supercoil

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.017

2017-03-22

国家自然科学基金(11274245, 10974146, 11304232)；温州大学创新基金(3162015033)

陈洋(1990—)，男，硕士研究生，研究方向为生命现象中的凝聚态物理。E-mail: speedmatrix2006@126.com

*通信作者，杨光参。E-mail: yanggc@wzu.edu.cn

Q71

A

1002-4026(2017)04-0106-06