川芎嗪联合顺铂对肺腺癌小鼠的抑瘤效果及其作用机制

马方旭，张秀珑，张志华，王布，汤建华

(1 河北北方学院，河北张家口075000；2 河北北方学院附属第一医院)

川芎嗪联合顺铂对肺腺癌小鼠的抑瘤效果及其作用机制

马方旭1，张秀珑2，张志华2，王布2，汤建华2

(1 河北北方学院，河北张家口075000；2 河北北方学院附属第一医院)

目的 探讨川芎嗪(TMP)联合顺铂(DDP)对肺腺癌小鼠的抑瘤效果及其作用机制。方法 将56只C57BL/6小鼠随机均分为生理盐水组、DDP组、TMP组、TMP联合DDP组。各组右腋皮下接种Lewis肺腺癌细胞，建立移植瘤模型。接种第7天，生理盐水组腹腔注射生理盐水0.2 mL，TMP组腹腔注射TMP 100 mg/kg，DDP组腹腔注射DDP 2 mg/kg，TMP联合DDP组腹腔注射TMP及DDP，剂量同上，每天1次，连续2周。末次注射24 h，各组均眼球取血，检测血清CXCL16、TNF-α；断颈处死，称取瘤质量，计算抑瘤率；取部分肿瘤组织，检测CXCL16、TNF-α蛋白相对表达量。结果 DDP组、TMP组、TMP联合DDP组抑瘤率分别为40.74%、21.69%、61.11%，TMP联合DDP组抑瘤率明显高于DDP组、TMP组(P均<0.05)，而DDP组与TMP组比较P>0.05。DDP组、TMP组、TMP联合DDP组血清CXCL16水平及肿瘤组织CXCL16蛋白相对表达量均低于生理盐水组，以TMP联合DDP组最低(P均<0.05)；血清TNF-α水平及肿瘤组织TNF-α蛋白相对表达量均高于生理盐水组，以TMP联合DDP组最高(P均<0.05)；DDP组与TMP组血清CXCL16、TNF-α水平及肿瘤组织CXCL16、TNF-α蛋白相对表达量比较P均>0.05。结论 TMP、DDP对肺腺癌小鼠均有一定抑瘤作用，二者联合抑瘤效果更佳；其作用机制可能与上调TNF-α表达、下调CXCL16表达有关。

肺腺癌；川芎嗪；顺铂；趋化因子配体16；肿瘤坏死因子α

肺癌是全球范围内发病率最高的恶性肿瘤之一，其中约50%为肺腺癌。手术、放化疗及靶向治疗是目前治疗肺腺癌的主要方法，但总体治疗效果较差。川芎嗪(TMP)是临床常用活血化瘀药川芎的主要活性成分，属于酰胺类生物碱。TMP作为血管新生抑制剂，不但可直接抑制肿瘤生长，还可提高化疗药物免疫调节作用，间接发挥抗肿瘤作用[1]。顺铂(DDP)是临床常用的抗肿瘤药，具有抗肿瘤谱广、作用强，可与多种抗肿瘤药有协同作用且无交叉耐药等特点。故理论上TMP辅助治疗能提高DDP的化疗效果[2]，但目前关于二者联合用于肺腺癌治疗的报道较少。CXCL16是近年新发现的一种趋化因子，具有促血管新生作用[3]。TNF-α是目前公认抗肿瘤作用最强的细胞因子。TMP联合DDP是否通过CXCL16、TNF-α发挥作用尚不清楚。2016年2～8月，我们观察了TMP联合DDP对肺腺癌小鼠的抑瘤效果，现分析结果并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性C57BL/6小鼠56只，5～6周龄，体质量20～22 g，购自中国军事科学院实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK2011- 0004。Lewis肺腺癌瘤株，由中国科学院上海生命科学院细胞库提供。HS-1300-U型超净工作台，上海博泰实验设备有限公司；倒置相差显微镜，日本Olympus公司；SpectraMax M3型多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司。盐酸川芎嗪注射液，广东南国药业有限公司；注射用顺铂，齐鲁制药有限公司。DMEM高糖培养基，美国Gibco公司；FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司；兔抗鼠CXCL16抗体，北京博奥森生物技术有限公司；兔抗鼠TNF-α抗体，武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒，北京庄盟国际生物基因科技有限公司；EDTA，美国Gibco公司；小鼠CXCL16 ELISA试剂盒，上海研晶生化试剂有限公司；小鼠TNF-α ELISA试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 模型制备及分组处理 取Lewis肺腺癌细胞，接种于含15% FBS的DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养48 h，用含EDTA的胰酶消化后传代培养。取对数生长期Lewis肺腺癌细胞，1 500 r/min离心5 min，用生理盐水制备密度为1×107个/mL的细胞悬液。取细胞悬液0.2 mL，接种于小鼠右腋皮下，制备Lewis肺腺癌模型。接种第2天，随机将小鼠分为生理盐水组、TMP组、DDP组、TMP联合DDP组，每组14只。接种第7天，所有小鼠可触及直径2～3 mm的肿瘤，表明模型制备成功。模型制备成功同日，生理盐水组腹腔注射生理盐水0.2 mL，TMP组腹腔注射TMP 100 mg/kg，DDP组腹腔注射DDP 2 mg/kg；TMP联合DDP组腹腔注射TMP 100 mg/kg+DDP 2 mg/kg。每天1次，连续2周。

1.3 相关指标观察

1.3.1 血清CXCL16、TNF-α水平 末次注射24 h，眼球取血，静置30 min，2 000 r/min离心15 min，收集上清液，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法检测血清CXCL16、TNF-α。所有操作严格按试剂盒说明进行。

1.3.2 抑瘤率 各组眼球取血后，断颈处死，分离腋下肿瘤组织，清理干净后称质量，计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组肿瘤质量-观察组肿瘤质量)/对照组肿瘤质量×100%。

1.3.3 肿瘤组织CXCL16、TNF-α蛋白表达 采用免疫组化SP法。取各组肿瘤组织，4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，4 μm厚切片。切片经脱蜡水化，97 ℃枸橼酸盐修复液修复，室温冷却10 min，5% BSA常温封闭15 min，分别滴加兔抗小鼠CXCL16一抗(1∶50)或TNF-α一抗(1∶100)，以PBS代替一抗作为阴性对照，湿盒30 min，4 ℃冰箱过夜。次日37 ℃复温45 min，甩去多余液体，PBS冲洗。用滤纸将组织周围的液体吸干，加入羊抗兔二抗(1∶200)，37 ℃恒温箱孵育30 min，PBS冲洗。DAB避光染色2 min，苏木素复染，氨水返蓝，常规脱水，透明，封片，显微镜下拍照观察。CXCL16或TNF-α蛋白阳性表达定位于胞质或胞膜，呈棕黄色颗粒状。采用Image-proplus6.0软件分析图像，统计积分光密度(IOD)值[4]。以IOD值代表目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组血清CXCL16、TNF-α水平比较 见表1。

2.2 各组抑瘤率比较 生理盐水组、DDP组、TMP组、TMP联合DDP组肿瘤质量分别为(3.78±0.09)、(2.24±0.26)、(2.96±0.25)、(1.47±0.30)g，抑瘤率分别为0、40.74%、21.69%、61.11%。TMP联合DDP组抑瘤率明显高于DDP组、TMP组(P均<0.05)，而DDP组与TMP组比较P>0.05。

表1 各组血清CXCL16、TNF-α水平比较

注：与生理盐水组比较，*P<0.05；与DDP组比较，#P<0.05；与TMP组比较，△P<0.05。

2.3 各组肿瘤组织CXCL16、TNF-α蛋白表达比较 见表2。

表2 各组肿瘤组织CXCL16、TNF-α蛋白相对表达量比较

注：与生理盐水组比较，*P<0.05；与DDP组比较，#P<0.05；与TMP组比较，△P<0.05。

3 讨论

肺腺癌细胞主要来源于支气管黏膜上皮，一般情况下肿瘤生长较缓慢，但早期即可发生血行转移。因早期无明显临床症状，多数患者就诊时已属中晚期。肺腺癌的治疗方法较多，但含铂类的化疗方案仍占有重要地位。近年来随着对中医药理研究的深入，发现中药辅助西药化疗不但能增加化疗药物敏感性，增强化疗效果，还能降低化疗药物引起的毒副作用，提高患者机体免疫力，延长患者生存期[5，6]。因此，探索高效低毒的增敏剂以增强化疗药物疗效，成为当前研究的热点。

TMP是中药川芎、当归的主要活性成分，其有效化学成分为四甲基吡嗪，具有抗炎、抗凋亡、舒张血管等多种生物学活性，在心脑血管病、消化系统疾病和呼吸系统疾病中应用较为广泛[7]。近年研究发现，TMP不仅能直接杀伤肿瘤细胞，还能间接抑制肿瘤血管生成，继而抑制肿瘤生长[8]。研究发现，TMP能够诱导肺癌细胞G1期阻滞和早期凋亡[9]； TMP能够引起U937细胞中凋亡抑制因子、凋亡促进因子及细胞周期调控蛋白的变化，启动凋亡程序，诱导细胞凋亡[10]；TMP还可抑制人骨肉瘤MG-63细胞生长，其机制可能是通过促进MG-63细胞凋亡、诱导细胞G0/G1期阻滞、抑制NF-κB及其靶基因蛋白表达等[11]；TMP能通过上调NK细胞等的生物学活性，调控Th2类细胞相关因子的表达，提高机体对肿瘤的免疫应答效果，从而增强机体对肿瘤细胞的免疫杀伤作用，间接发挥抗肿瘤作用[12]；TMP还可增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，降低化疗药物引起的毒副作用，改善肿瘤组织周围的微环境及肿瘤细胞的缺氧环境，增强肿瘤在放疗中的敏感性[13,14]。DDP是临床应用最广泛的抗肿瘤药，可与DNA结合形成DDP-DNA复合物，导致DNA复制障碍，从而抑制肿瘤细胞分裂，为非特异性细胞周期化疗药物。有研究表明，TMP联合DDP不仅能增强DDP的化疗效果，还能降低化疗药物引起的毒副作用[15，16]。本研究结果显示，TMP联合DDP组抑瘤率明显高于DDP组、TMP组，而DDP组与TMP组比较差异无统计学意义。说明TMP和DDP均具有抑瘤作用，二者联合应用效果更佳。

CXCL16是近年发现的一种趋化因子，属于CXC趋化因子家族。目前国内外对CXCL16的研究主要集中于心血管疾病、免疫性疾病及炎症性疾病等方面。除在先天性免疫和获得性免疫介导的机体防御中具有重要作用外，CXCL16还能介导细胞间黏附和血管生成[17]。CXCL16与其惟一的受体CXCR6结合，可激活NF-κB和AKT/mTOR等信号通路，促进肿瘤的侵袭和转移[18]。TNF-α是一种具有广泛生物学活性的多肽类细胞因子，是迄今为止抗肿瘤活性最强的细胞因子。TNF-α不仅能通过调控NF-κB信号通路干扰肿瘤血管系统、诱导肿瘤细胞凋亡和增强机体免疫力[19，20]，还可诱导肿瘤血管的高渗透性，使肿瘤部位化疗药物浓度升高，提高抗肿瘤效果[21]。本研究结果显示，DDP组、TMP组、TMP联合DDP组血清CXCL16水平及肿瘤组织CXCL16蛋白表达均低于生理盐水组，以TMP联合DDP组最低；血清TNF-α水平及肿瘤组织TNF-α蛋白相对表达量均高于生理盐水组，以TMP联合DDP组最高；DDP组与TMP组血清CXCL16、TNF-α水平及肿瘤组织CXCL16、TNF-α蛋白相对表达量比较均无统计学差异。表明TMP和DDP均能通过抑制CXCL16表达，促进TNF-α表达，抑制肿瘤血管生成，继而抑制肿瘤生长，二者联合应用效果更佳。

综上所述，TMP、DDP对肺腺癌小鼠均有一定抑瘤作用，二者联合应用抑瘤效果更佳；其作用机制可能与上调TNF-α表达、下调CXCL16表达有关，但其具体作用机制尚需进一步研究。

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河北省医学科学研究重点课题资助计划项目(20170185)。

张秀珑(E-mail： zzh19641229@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.011

R734.2

A

1002- 266X(2017)28- 0040- 03

2016- 09-27)