p38 MAPK在MRP8/14诱导小鼠胚胎成纤维细胞凋亡中的作用

王娟，陈小欢，李磊，卢夏英，姜勇

(南方医科大学病理生理学教研室 广东省蛋白质组学重点实验室，广州510515)

·基础研究·

p38 MAPK在MRP8/14诱导小鼠胚胎成纤维细胞凋亡中的作用

王娟，陈小欢，李磊，卢夏英，姜勇

(南方医科大学病理生理学教研室 广东省蛋白质组学重点实验室，广州510515)

目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)对髓样相关蛋白8(MRP8)/髓样相关蛋白14(MRP14)诱导小鼠胚胎成纤维细胞凋亡的影响。方法 制备MRP8、MRP14、MRP8/14备用。分别取p38+/+和p38-/-细胞，随机分为空白对照组、MRP8组、MRP14组、MRP8/14组。MRP8组、MRP14组、MRP8/14组分别加入50 μg/mL MRP8、MRP14和MRP8/14。空白对照组加入等体积的DMEM培养液。各组干预24、48 h，采用MTT法检测p38+/+和p38-/-细胞活力。采用流式细胞术检测空白对照组及MRP8/14干预24、48 h组p38+/+和p38-/-细胞凋亡率。采用MTT法检测空白对照组、MRP8/14组以及TLR4受体抑制剂TAK242或RAGE中和抗体处理的MRP8/14(分别设为MRP8/14+TAK242组、MRP8/14+RAGE组)干预24 h p38+/+细胞活力。采用MTT法和流式细胞术检测空白对照组、MRP8/14组以及p38激酶抑制剂SB203580处理的MRP8/14(设为MRP8/14+SB203580组)干预24 h p38+/+细胞活力和凋亡率。采用Western blotting法检测MRP8/14干预0、1、2、4、6、8 h p38+/+细胞p38 MAPK磷酸化。结果 MRP8组、MRP14组、MRP8/14组干预24、48 h p38+/+、p38-/-细胞活力均低于空白对照组(P均<0.05)，但无论MRP8/14组干预24 h还是48 h，p38-/-细胞活力明显高于p38+/+细胞(P均<0.05)。MRP8/14干预24、48 h组p38+/+细胞凋亡率均高于空白对照组，且MRP8/14干预48 h组细胞凋亡率更高(P均<0.05)；而MRP8/14干预24、48 h组p38-/-细胞凋亡率均未见明显变化(P均>0.05)。MRP8/14组、MRP8/14+RAGE组干预24 h p38+/+细胞活力低于空白对照组、MRP8/14+TAK242组干预24 h(P均<0.05)。MRP8/14+SB203580组干预24 h p38+/+细胞活力较MRP8/14组干预24 h明显升高，细胞凋亡率较MRP8/14组干预24 h明显降低(P均<0.05)。MRP8/14干预2、4、6 h p38+/+细胞p38 MAPK磷酸化水平明显高于干预0、1、8 h(P均<0.05)。结论 p38 MAPK能促进MRP8/14诱导的小鼠成纤维细胞凋亡，其机制可能与TLR4-p38 MAPK信号通路激活有关。

胚胎成纤维细胞；髓样相关蛋白8；髓样相关蛋白14；p38丝裂原活化蛋白激酶;细胞凋亡;小鼠

髓样相关蛋白8(MRP8)、髓样相关蛋白14(MRP14)是S100蛋白家族的重要成员，被认为是机体重要的内源性损伤相关模式分子，可参与众多炎症相关疾病的发生、发展[1～3]。S100蛋白通常以同源或异源二聚体的形式发挥生物学功能[4]。一般认为，MRP8/14以异源二聚体的形式发挥生物学功能[5]。成纤维细胞可参与机体损伤修复及瘢痕形成，最近研究发现，成纤维细胞还可作为“岗哨细胞”启动机体炎症反应[6，7]，而MRP8、MRP14均能够活化成纤维细胞，进而介导组织器官的损伤和纤维化过程[8，9]。关于MRP8、MRP14是否参与成纤维细胞的凋亡过程，目前尚不清楚。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)是MAPK家族的重要成员之一，参与多种信号通路引起的级联反应[10，11]。有研究显示，MRP8/14介导的细胞凋亡可能与p38 MAPK信号通路有关[12]。2015年3月～2016年12月，本研究观察了p38 MAPK对MRP8/14诱导小鼠胚胎成纤维细胞凋亡的影响，现分析结果并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料E.coliDE3感受态细胞由本实验室保存。小鼠胚胎成纤维细胞p38+/+和p38-/-细胞系，由美国斯克利普斯研究所韩家淮博士馈赠，本实验室保存。主要仪器：流式细胞仪，美国BD公司；垂直电泳仪，美国Bio-Rad公司；KodakIS4000R图像工作站，美国Kodak公司。主要试剂：pET14b-MCS-MRP8、pET14b-MCS-MRP14原核表达载体，由本实验室构建、保存；DMEM培养液、FBS，美国Gibco公司；LB培养基，美国Affymetrix公司；Ni2+-NTA-Resin，德国Qiagen公司；噻唑蓝(MTT)，美国Sigma-Aldrich公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V(Annexin V)细胞凋亡检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司；Bradford蛋白定量试剂盒，北京雷根生物技术有限公司；total-p38和磷酸化p38抗体及辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗兔IgG，美国Cell Signaling Technology公司；p38 MAPK抑制剂SB203580，德国Merck公司；Toll样受体4(TLR4)抑制剂TAK242，美国ApexBio公司；晚期糖基化终产物受体(RAGE)中和抗体，美国R&D公司。

1.2 MRP8/14制备 热休克法将融合蛋白重组载体转化E.coliDE3感受态细胞：取E.coliDE3感受态细胞悬液100 μL，加入pET14b-MCS-mMRP8或pET14b-MCS-mMRP14质粒50 ng，混匀，冰上放置30 min；42 ℃热激90 s，冰上放置5 min；加入LB培养基900 μL，37 ℃孵育1.5 h；1 000 r/min离心5 min，吸弃上清700 μL；剩余液体均匀涂布于含氨苄青霉素的培养板上，37 ℃倒置培养过夜。蛋白纯化：待培养板长出转化菌斑，挑取单菌落，接种于5 mL氨苄西林阳性的LB培养基中过夜；按1∶100稀释在LB培养基中扩大培养，待菌液光密度(OD)值达到0.6时，加入适量IPTG(终浓度为1 mmol/L)，25 ℃摇床500 r/min继续培养10 h；4 ℃ 5 000 r/min离心5 min，收集沉淀；将沉淀重悬于5 mL结合缓冲液(10 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl)，冰上超声波裂解，4 ℃ 39 000×g离心20 min，收集上清。将上清置于含Ni2+-NTA-Resin的层析柱中，分别用10倍体积的结合缓冲液和6倍体积的冲洗缓冲液(20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl)洗涤，500 μL洗脱缓冲液(250 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl)洗脱重组蛋白，经PBS透析、0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，SDS-PAGE纯化His-MRP8和His-MRP14融合蛋白。根据文献[13]将MRP8与MRP14等摩尔比混合，室温孵育30 min，即为MRP8/14。

1.3 MRP8/14对小鼠胚胎成纤维细胞活力影响的观察 采用MTT法。分别取p38+/+和p38-/-细胞，接种于96孔板中，每孔1×104个；加入含10% FBS的DMEM培养液培养24 h，待细胞充分贴壁后，吸净旧培养基，加入不含FBS的DMEM培养液，继续培养6 h。随机将细胞分为4组：空白对照组、MRP8组、MRP14组、MRP8/14组，每组设5个复孔。MRP8组、MRP14组、MRP8/14组每孔加入50 μg/mL MRP8、MRP14和MRP8/14，空白对照组加入等体积的DMEM培养液。各组分别干预24、48 h，吸净旧培养基，加入适量MTT，使其终浓度为0.5 mg/mL，继续培养4 h。小心吸去孔内培养液，终止反应。然后加入DMSO 100 μL，摇床上低速振荡10 min。在多光谱微孔板阅读器上观察各孔490 nm波长处的OD值。以OD490值代表细胞活力。

1.4 MRP8/14对小鼠胚胎成纤维细胞凋亡影响的观察 采用流式细胞术。取p38+/+和p38-/-细胞分别按5×105个/皿接种于60 mm细胞培养皿中，随机将细胞分为空白对照组、MRP8/14干预24 h组、MRP8/14干预48 h组。当细胞生长至约90%融合时，MRP8/14干预24 h组、MRP8/14干预48 h组分别加入50 μg/mL MRP8/14干预24、48 h，空白对照组加入等体积的DMEM培养液。干预结束，用不含EDTA的胰酶消化细胞，1 000 r/min离心5 min，收集细胞。每组各取1×106个细胞，用冰冷的PBS漂洗2次，重悬于500 μL结合缓冲液中，然后加入2 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶，室温避光孵育15 min。PBS漂洗1次，并重悬于适量流式鞘液中，上机检测细胞凋亡率。

1.5 TLR4、RAGE抑制剂对MRP8/14干预后p38+/+细胞活力影响的观察 取p38+/+细胞按5×105个/皿接种于60 mm细胞培养皿中，随机将细胞分为空白对照组、MRP8/14组、MRP8/14+TAK242组、MRP8/14+RAGE组，MRP8/14+TAK242组、MRP8/14+RAGE组分别用TAK242或RAGE中和抗体封闭1 h。当细胞生长至约90%融合时，MRP8/14组、MRP8/14+TAK242组、MRP8/14+RAGE中和抗体组分别加入50 μg/mL MRP8/14干预24 h，空白对照组仅加入等体积的DMEM培养液。按1.3中的方法收集细胞并检测细胞活力。

1.6 p38 MAPK抑制剂对MRP 8/14干预后p38+/+细胞活力影响的观察 取p38+/+细胞按5×105个/皿接种于60 mm细胞培养皿中，随机将细胞分为空白对照组、MRP8/14组、MRP8/14+SB203580组，其中MRP8/14+ SB203580组预先用20 μmol/L SB203580处理1 h。当细胞生长至约90%融合时，MRP8/14组、MRP8/14+ SB203580组分别加入50 μg/mL MRP8/14干预24 h，空白对照组加入等体积的DMEM培养液。分别按1.3、1.4中的方法收集细胞并检测细胞活力和凋亡率。

1.7 MRP8/14对p38+/+细胞p38 MAPK磷酸化影响的观察 采用Western blotting法。取p38+/+细胞按5×105个/皿接种于60 mm细胞培养皿中，常规培养。当细胞生长至约90%融合时，加入50 μg/mL MRP8/14干预，分别于干预0、1、2、4、6、8 h时收集细胞，加入150 μL细胞裂解液，冰上裂解20 min。利用细胞刮刮取细胞裂解物，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清。Bradford蛋白定量试剂盒进行蛋白定量后，每时间点取总蛋白40 μg，行SDS-PAGE，采用半干转移法将凝胶蛋白转印至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的1×TBST缓冲液(20 mmol/L Tris-base，137 mmol/L NaCl，0.1% 吐温-20)室温封闭1 h，TBST缓冲液漂洗5 min×3次；一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液漂洗5 min×3次；HRP偶联的抗兔IgG二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，TBST缓冲液漂洗5 min×3次。ECL化学发光显色，采用KodakIS4000R图像工作站取像分析。

2 结果

2.1 各组干预24、48 h p38+/+及p38-/-细胞活力比较 见表1。

表1 各组干预24、48 h p38+/+及p38-/-细胞活力比较

注：与空白对照组干预24 h比较，*P<0.05；与空白对照组干预48 h相比，#P<0.05；与同组同干预时间p38+/+细胞比较，△P<0.05。

2.2 各组干预后p38+/+、p38-/-细胞凋亡率比较 见表2。

2.3 TLR4、RAGE抑制剂对MRP8/14干预后p38+/+细胞活力的影响 空白对照组p38+/+细胞

表2 各组干预后p38+/+、p38-/-细胞凋亡率比较

注：与空白对照组比较，*P<0.01。活力为0.63±0.14，MRP8/14组为0.28±0.07，MRP8/14+TAK242组为0.59±0.11，MRP8/14+RAGE组为0.31±0.04。MRP8/14组、MRP8/14+RAGE组p38+/+细胞活力低于空白对照组、MRP8/14+TAK242组(P均<0.05)，而MRP8/14组与MRP8/14+RAGE组、空白对照组与MRP8/14+TAK242组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.4 p38 MAPK抑制剂对MRP8/14干预后p38+/+细胞活力和细胞凋亡率的影响 见表3。

表3 各组干预后p38+/+细胞活力和凋亡率比较±s)

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与MRP8/14组比较，#P<0.05。

2.5 MRP8/14干预后p38+/+细胞p38 MAPK磷酸化水平变化 MRP8/14干预0、1、2、4、6、8 h，p38+/+细胞p38 MAPK磷酸化水平分别为2.77±0.25、2.80±0.20、22.1±2.52、34.71±2.02、46.00±2.18、2.50±0.50。MRP8/14干预2、4、6 h p38+/+细胞p38 MAPK磷酸化水平明显高于干预0、1、8 h(P均<0.05)。

3 讨论

MRP8和MRP14作为S100蛋白家族的成员，具有丰富的生物学功能，在多种疾病中高表达，近年来受到广泛关注[1,2，13～16]。MRP8/14的生物学功能极其丰富，可参与细胞骨架重塑、蛋白质磷酸化、钙离子稳态调节、中性粒细胞NADPH氧化酶调节等，对维持细胞稳态至关重要[17～19]。生理状态下，MRP8/14表达于中性粒细胞和单核细胞。病理状态下，细胞内MRP8/14可被活化，释放到细胞外，参与细胞多种生物学功能，包括启动炎症反应、介导细胞增殖与分化等[1,20]。已有研究证实，低浓度MRP8/14可促进细胞生长，而高浓度时(50～250 μg/mL)则诱导细胞凋亡，具有双重作用[21，22]。

成纤维细胞是机体细胞外基质的重要组成部分，主要参与机体创伤修复、瘢痕形成等过程[6，7]。某些亚群的成纤维细胞能被细菌产物、损伤组织释放产物及促炎性细胞因子等激活，通过促进细胞因子和趋化因子的合成与分泌，调动白细胞杀灭细菌[23，24]。说明成纤维细胞可参与机体的炎症反应过程。Zhang等[25]研究发现，MRP8、MRP14可通过促进表皮成纤维细胞的活化导致真皮纤维化；Zhong等[8]研究发现，心肌细胞释放的MRP8、MRP14能够诱导心肌成纤维细胞活化，从而参与心脏疾病过程中心肌细胞的炎症反应和纤维化；Wu等[26]研究亦发现，MRP8/14通过活化心肌成纤维细胞介导高血压中心脏的炎症和损伤。以上研究说明，MRP8/14能够诱导多种疾病状态下成纤维细胞的活化。但目前关于MRP8/14诱导成纤维细胞增殖和凋亡的报道相对较少。本研究结果显示，MRP8组、MRP14组、MRP8/14组干预24、48 h p38+/+、p38-/-细胞活力均低于空白对照组，但无论MRP8/14组干预24 h还是48 h，p38-/-细胞活性明显高于p38+/+细胞。本研究结果还显示，MRP8/14干预24、48 h组p38+/+细胞凋亡率均高于空白对照组，且MRP8/14干预48 h组细胞凋亡率更高；而MRP8/14干预24、48 h组p38-/-细胞凋亡率均未见明显变化。提示MRP8/14能诱导成纤维细胞凋亡。

MRP8/14发挥功能依赖于与靶细胞表面特异性受体的结合。已有报道，MRP8/14的特异性受体包括RAGE、TLR4等[13,21，27]。本研究结果显示，MRP8/14组、MRP8/14+RAGE组p38+/+细胞活力低于空白对照组、MRP8/14+TAK242组，而MRP8/14组与MRP8/14+RAGE组、空白对照组与MRP8/14+TAK242组比较差异无统计学意义。说明MRP8/14主要通过与细胞膜表面的TLR4结合影响成纤维细胞活性。

p38 MAPK是MAPKs通路中的重要分支，可参与多种信号通路引起的级联反应[10]。p38 MAPK在介导细胞凋亡中的作用机制尚不明确。有研究表明，p38 MAPK特异性抑制剂SB203580可通过调节脂多糖干预ERK信号通路活化，继而促进中性粒细胞凋亡[28]。也有研究发现，活化的p38 MAPK能够增强化疗药物引起的细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤效应[29]。Lee等[12]研究发现，MRP14通过诱导炎性细胞因子的释放，进而激活下游的信号分子，如p38 MAPK，继而发挥抗细胞凋亡作用。本研究结果显示，MRP8/14+SB203580组p38+/+细胞活力较MRP8/14组明显升高，细胞凋亡率较MRP8/14组明显降低。说明p38 MAPK在MRP8/14诱导小鼠成纤维细胞凋亡中具有重要作用。进一步研究发现，MRP8/14干预p38+/+细胞2 h，p38 MAPK磷酸化水平明显升高，6 h达到高峰，8 h基本恢复正常水平。说明MRP8/14能够以时间依赖性模式诱导p38 MAPK磷酸化。

综上所述，p38 MAPK能促进MRP8/14诱导的小鼠成纤维细胞凋亡，这一效应可能是通过TLR4-p38 MAPK信号通路激活实现的。

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Role of p38 MAPK on apoptosis of mouse embryo fibroblasts induced by MRP8/14

WANGJuan,CHENXiaohuan,LILei,LUXiaying,JIANGYong

(DepartmentofPathophysiology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Objective To explore the role of p38 MAPK on the apoptosis of mouse embryo fibroblasts induced by myeloid-related protein 8 (MRP8)/myeloid-related protein 14 (MRP14). Methods MTT assay was performed to detect the cell viability of p38+/+and p38-/-cells in the control group and groups in which cells were treated with 50 μg/mL MRP8, MRP14, and MRP8/14 for 24 h and 48 h; flow cytometry was applied to detect the apoptosis rate of p38+/+and p38-/-cells in the control group and groups in which cells were treated with 50 μg/mL MRP8/14 for 24 h and 48 h; MTT assay was performed to detect the cell viability of p38+/+cells in the control group, MRP8/14 group, MRP8/14+TAK242(TLR4 inhibitor) group and MRP8/14+RAGE neutralized antibody group for 24 h; MTT and flow cytometry were used to analyze the cell viability and the apoptosis rate of p38+/+cells in the control group, MRP8/14 group, MRP8/14+SB203580 (p38 MAPK inhibitor) group for 24 h; Western blotting was used to detect the phosphorylation changes of p38 MAPK in p38+/+cells treated with MRP8/14 for 0, 1, 2, 4, 6, and 8 h, respectively. Results The cell viability of p38+/+and p38-/-cells in the groups treated with MRP8, MRP14, and MRP8/14 for 24 h and 48 h was lower than that of the control group (P<0.05). At the same time, the cell viability of p38-/-cells was significantly higher than that of p38+/+cells in the MRP8/14 group at 24 and 48 h (P<0.05). The apoptosis rate of p38+/+cells in the MRP8/14 group at 24 and 48 h was higher than that of the control group, especially at 48 h (allP<0.05). However, the apoptosis rate of p38-/-cells did not change after MRP8/14 treatment for 24 and 48 h. The cell viability of p38+/+cells in the MRP8/14 group and MRP8/14+RAGE neutralized antibody group was lower than that in the control group and MRP8/14 +TAK242 group (P<0.05). The cell viability of p38+/+cells in the MRP8/14+SB203580 group was higher than that of the MRP8/14 alone group, and the apoptosis rate of p38+/+cells in the MRP8/14+SB203580 group was lower than that of the MRP8/14 alone group (P<0.05). The phosphorylation level of p38 MAPK in p38+/+cells was significantly higher at 2, 4, and 6 h after MRP8/14 treatment than that at 0, 1, and 8 h (P<0.05). Conclusion MRP8/14 can induce the apoptosis of mouse embryo fibroblasts via the activation of TLR4-p38 MAPK pathway.

embryo fibroblasts; myeloid-related protein 8; myeloid-related protein 14; p38 mitogen-activated protein kinase; apoptosis; mouse

国家自然科学基金资助项目(81501691)。

姜勇(E-mail： yjiang48231@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.008

R329.2

A

1002- 266X(2017)28- 0028- 05

2017- 02-26)