Ath-miR169d介导的拟南芥叶片发育的分子调控机制

张敏，朱明,，李文宗，马洁，刘悦萍，江海洋，王磊，徐妙云



Ath-miR169d介导的拟南芥叶片发育的分子调控机制

张敏1，朱明1,2，李文宗1，马洁3，刘悦萍3，江海洋2，王磊1，徐妙云1

（1中国农业科学院生物技术研究所，北京100081；2安徽农业大学生命科学学院，合肥230036；3北京农学院生物科学与工程学院，北京102206）

【目的】探究ath-miR169d在拟南芥叶片发育过程中的作用，明确其调控的分子机制，为增强叶菜类植物的光合效率以及增加生物量和提高作物产量提供理论依据。【方法】选取ath-miR169d过表达和降低表达的拟南芥转基因株系以及野生型拟南芥，在22℃、相对湿度60%、16 h/8 h光周期条件下培养，观察不同生长阶段叶片发育表型的差异；同时构建pmiR169d::GUS表达载体，转化农杆菌EHA105，并利用蘸花法转化野生型拟南芥（Columbia，Col-0），获得转基因拟南芥，利用GUS染色对ath-miR169d在拟南芥不同组织器官中的表达模式进行研究；选取8周龄的过表达材料和野生型对照株系，对其叶片表皮细胞形态进行扫描电镜分析；对4周龄过表达材料和野生型对照株系的幼苗顶端分生组织和叶片中总IAA进行定量分析，并进行基因芯片表达谱分析，筛选差异表达基因；通过实时荧光定量PCR对生长素信号途径部分差异表达关键基因的表达情况进行分析。【结果】Ath-miR169d过表达拟南芥株系莲座叶数目较野生型少，叶片小，而ath-miR169d降低表达的拟南芥株系的莲座叶较野生型多，叶片大，且在抽薹和种子成熟之后还持续长出新叶，而野生型莲座叶则在种子成熟之后逐渐衰老干枯；扫描电镜观察到ath-miR169d过表达拟南芥株系叶片中表皮细胞小于野生型；表达模式分析表明，ath-miR169d主要在顶端分生组织（shoot apical meristem，SAM）和叶片维管系统中表达，且新叶中表达强。SAM是产生生长素的部位，IAA测定结果表明ath-miR169d过表达拟南芥株系中IAA含量显著降低，为野生型植株的38.6%，同时基因芯片表达谱分析也验证了ath-miR169d参与调控植物体内激素信号转导途径。进一步研究发现，ath-miR169d过表达株系中生长素合成关键基因和转运体蛋白基因均显著下调表达，而具有转录抑制功能的生长素响应因子1和2基因（和）表达上调；STTM miR169d低表达株系中这4个基因的表达则为相反趋势，该结果与观察到的表型相一致。【结论】Ath-miR169d通过介导生长素信号途径参与了拟南芥叶片发育的调控，ath-miR169d表达量发生变化会影响叶片的数量和大小，最终影响整个植株的生物量。

拟南芥；miR169；叶片；发育；生长素信号途径

0 引言

【研究意义】在农业生产中，尤其对于食叶类蔬菜等，提高植物生物量，可以提高生产效率，降低成本，具有重要意义。叶片作为光合作用的器官，对于植物的发育和生物量的积累至关重要。叶片的发育包括叶原基的起始、极性的建立和叶片的扩展。叶片的发育受小RNA、转录因子和激素的协调调控[1]。越来越多的研究表明，miRNA作为一个关键调控因子启动和参与植物体内多条发育途径。植物中最大的miR169家族基因，参与植物的逆境响应和生长发育调控。利用已有的过表达和低表达的转基因拟南芥材料，解析其介导叶片发育调控的分子机制，可为调节植物营养生长，增加总生物量提供理论依据。【前人研究进展】MiR156/SPL调控模块与TCP4互作形成的复合体参与拟南芥的叶片发育[2]。miR160通过靶向调节3个ARF同源基因、和参与调控叶原基的形成和莲座叶正确叶序的建立[3-5]。MiR164通过对（CUP-SHAPED COTYLEDON1）和的调控介导器官边界的形成[5-7]。miR319通过对的靶向调节参与叶片发育过程中的细胞分裂和生长[8-9]。生长素产生于顶端分生组织（shoot apical meristem，SAM），参与调节植物发育的多个过程，包括根和叶片形态建成、器官形成和维管组织的发育等[10]。生长素的合成涉及多条发育进程[11]，其中主要的天然生长素形式，吲哚乙酸IAA的合成主要经过两步化学反应，首先色氨酸（Trp）通过转氨作用形成吲哚丙酮酸（IPA），然后IPA再被YUCCA（YUC）家族基因编码的含黄素单加氧酶催化形成IAA[12]。目前研究发现，PIN蛋白家族是主要的介导生长素由胞内向胞外、以及细胞之间定向移动的转运体[13]。拟南芥miR169家族包括14个基因，最终产生4个成熟的miRNA异构体（a、b/c、d/e/f/g和h/i/j/k/l/m/n）。不同的miR169异构体在植物发育过程中表达模式不同[14]，其靶基因是转录因子NF-Y的A亚基[15]。NF-YA与NF-YB、NF-YC形成三聚体，发挥调控功能。研究表明，NF-Y转录因子参与植物发育、信号转导和逆境响应[16-22]。并且拟南芥miR169d/NF-YA2调控模块介导逆境诱导的早花[23]和根形态建成[24]。【本研究切入点】在前期研究中，发现过表达转基因植株莲座叶的生长受到影响，但其是否参与叶片发育的调控及其分子机制还未见报道。【拟解决的关键问题】通过对不同转基因材料的莲座叶表型、叶片表皮细胞的形态等指标的观察，结合表达模式的分析，以及内源生长素的定量检测和基因表达情况检测等研究，明确对叶片发育的影响，进而解析其分子调控机制。

1 材料与方法

试验于2015—2016年在中国农业科学院生物技术研究所完成。

1.1 植物材料

拟南芥哥伦比亚生态型（Col）。植物生长条件为22℃，相对湿度60%，光周期16 h/8 h。株系为作物基因组与遗传改良实验室保存[23]。

1.2 pmiR169d::GUS载体的构建和转基因株系的获得

通过PCR方法从基因组DNA中扩增ath-miR169d前体序列上游2 kb片段（引物序列分别为pmiR169d- FW：5′-ACCCTAACTCATGATGAAGG-3′和pmiR169d- RV：5′-CACCTGTCGACGTACTAGATC T-3′）。与pEASY-T1载体连接，转化，经测序验证后重组至植物双元载体pCAMBIA1303。并经蘸花法转化拟南芥Col野生型，筛选获得至少10个独立转化事件的转基因阳性材料。

1.3 STTM载体构建和转基因株系的获得

STTM是一类短的（~100 nt）人工合成非编码RNA，参照文献[25]模拟miR169d的前体序列，设计STTM序列（5′-caagtcatcTACcttg gctcaGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATA-3′，5′-TGGTCTAAAGAAGAAGAATcaagtcatcTACcttggctca-3′），斜体部分分别为HⅠ和Ⅰ酶切位点，中间48 nt为linker序列，可以形成一个弱的颈环结构，小写字体为能够与互补配对的序列，其中10—12 nt设计为3个不配对碱基突出部分，从而可以与结合并不被其降解，导致沉默。经测序验证正确后酶切连接至植物双元载体载体pPZP212上。该载体经蘸花法转化拟南芥Col野生型，并筛选获得至少10个独立转化事件的转基因阳性材料。

1.4 GUS染色

为了全面分析在拟南芥中的表达情况，将不同龄期的幼苗整株进行染色。具体步骤参考文献[26]方法。

1.5 总RNA、miRNA提取和实时荧光定量PCR

利用Trizol（ambion）提取拟南芥总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA（5×All-In-One RT MasterMix，abm，加拿大）。使用SYBR Premix Ex TaqTM（CodeQPK-201，TOYOBO）试剂进行实时荧光定量PCR分析，拟南芥作为内参。利用miRcute miRNA提取分离试剂盒（DP501，TIANGEN，北京）提取拟南芥的miRNA，然后反转录为cDNA（TIANGEN miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒，KR201），再用TIANGEN miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒（FP401），进行荧光定量PCR。拟南芥作为内参。每个基因型均做3个独立生物学重复，包含至少3个以上单株样品。所用仪器为ABI7500，利用2–ΔΔCT方法分析试验结果[27]，所用引物序列见表1，miRNA荧光定量的反向引物为试剂盒自带通用引物。

表1 实时荧光定量PCR引物

1.6 IAA的定量分析

16 h/8 h光周期条件下培养4周的拟南芥幼苗地上部分全部收获，转基因材料和野生型分别随机选5株混样（200 mg），委托中国科学院遗传发育研究所利用气相色谱-质谱联用进行IAA定量分析。

1.7 基因芯片分析

分别提取转基因株系和野生型的总RNA，利用Agilent 2100分析仪器检测总RNA的质量和数量，并通过变性琼脂糖凝胶检测RNA的完整度，对质检合格的RNA样品委托上海欧易公司进行基因芯片分析，所用芯片为拟南芥Agilent V4.0。

2 结果

2.1影响拟南芥莲座叶生长

前期研究发现ath-不仅参与调控拟南芥的开花时间[23]，同时也影响叶片的发育，过表达拟南芥的莲座叶与野生型相比少且小。为探究其对叶片发育的调控功能，通过构建并获得STTM[25]的转基因拟南芥株系，抑制了内源的表达。如图1-a为STTM的转基因拟南芥株系中的的相对表达量。与野生型相比，STTM株系莲座叶多且大（图1-b、1-c）。过表达株系的莲座叶直径是4.29 cm，短于野生型（5.03 cm），STTM株系是6.5 cm，大于野生型（图1-d）。而且，STTM株系会不断生长新叶，一直持续到抽薹结实后仍有新叶的发生及生长，但野生型在抽薹结实之后就不再长新叶（图1-c）。40 d苗龄的过表达株系莲座叶数为13.8，野生型和STTM分别为16.6和20.4（图1-d）。

表皮细胞的数目和大小决定了叶片的大小，为探究过表达株系叶片变小的原因，利用扫描电镜观察了各个拟南芥株系的表皮细胞形态。过表达株系叶片表皮细胞（图2-a）小于野生型株系的表皮细胞（图2-b），说明通过介导叶片表皮细胞的大小进而影响了叶片的大小。

2.3主要在拟南芥顶端分生组织和叶片维管系统中表达

为解析在拟南芥叶片发生和叶片发育中的功能，克隆的2 kb启动子片段，构建pmiR169d::GUS表达载体并获得了其转基因拟南芥株系。对pmiR169d::GUS转基因拟南芥株系染色分析结果表明，主要在顶端分生组织和叶维管系统中表达。随着pmiR169d::GUS幼苗的生长，报告基因的表达逐渐增强，且在新生叶片中的表达高于老叶片（图3）。顶端分生组织是叶原基形成的部位，维管系统则负责水分、矿质元素和营养物质的运输，因而在该部位的表达可能与叶片发育相关。

2.4过表达降低了转基因株系中内源IAA的含量

植物体内生长素主要产生于SAM，是植物器官发生的主要调节因子。考虑到在SAM中大量表达，为分析其是否影响拟南芥生长素的代谢，检测了4周龄地上部幼苗中内源生长素的含量，发现在过表达株系中，内源IAA含量与WT相比降低了38.6%（图4-a），说明参与了IAA代谢途径的调控。为进一步探究参与调控叶片起始和发育的分子机制，对4周龄过表达株系幼苗进行基因芯片表达谱分析。与野生型相比，分别有2 268和2 562个基因显著下调和上调表达（log2FC＞1 or＜-1 with-value of 0.05）。对表达发生显著变化的基因进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析，结果表明，在富集比例前10的代谢路径中，富集基因数量最多的是“次级代谢产物合成途径”和“植物激素信号转导途径”（图4-b），其中，有多个生长素信号途径基因表达发生了变化。

2.5过表达株系和STTM低表达株系中生长素信号途径基因表达发生变化

鉴于过表达拟南芥株系中IAA含量明显下降，推测IAA合成途径中的基因可能受到影响，通过对基因芯片表达谱分析发生IAA合成途径关键基因、外运载体蛋白基因的表达明显降低，采用qPCR的方法对这些基因在过表达株系和STTM低表达株系中的表达量进行检测。结果表明，与野生型相比，过表达株系中和表达显著下调，而STTM株系中这两个基因都显著上调表达（图5）。过表达株系中表达下调与IAA含量降低结果吻合，IAA的减少也导致IAA转运体的下调表达。Ellis等[28]报道IAA应答因子和的过表达促进叶片衰老，为了进一步分析和在过表达植株和低表达株系中的作用，对其表达进行了分析，结果表明，在过表达植株中和的表达明显上升，在低表达株系中则显著下调表达，因是转录抑制因子，推测其上调表达阻碍了叶片的发育，并促进植株衰老。

对于无数据区域，须将 NoData转为数值0，否则获得的阴影数据不完整，选择 [Spatial Analyst 工具][分类][重分类]工具完成，如图4。

3 讨论

miR169家族是植物中最大且进化保守的一个miRNA家族，其家族成员在调节胁迫应答和生长发育过程中发挥着重要的作用，的靶基因主要是NF-YA转录因子，miR169/NF-YA这个调控模块可以感受内源信号或外部环境的激活，使植物表现出增强适应内外环境变化的特性。对蒺藜状苜蓿的研究发现，在的5′端有一个内含子可以进行选择性剪切，在这个区域中有一个ORF可以编码一个蛋白（uORF1p），这个蛋白的表达可以下调，其与呈现出功能上的互补，在根瘤发育的早期阶段调控占主导地位，而在后期时uORF1p发挥显著功能[29]。LI等[21]研究表明miR169/NF-YA5调控模块可以响应干旱并提高拟南芥的抗旱性，拟南芥在缺水环境中表达受到抑制，也就脱离了的控制而上调表达，进而使植物抗旱性增强，经过进一步研究发现这条通路是ABA介导的。这些研究使得NF-YA的上游调控机制变得更加清晰，也为植物环境胁迫下的分子应答机制研究提供了理论支撑。作物基因组与遗传改良研究室王磊课题组前期在拟南芥中发现了受逆境胁迫诱导的另一个模块miR169/NFYA2，它可以通过响应逆境使植物提前开花，并且miR169/NF-YA2调控模块所引起的早花现象独立于其他开花调控途径[23]。而且异构体及其靶基因参与调控了拟南芥根的形态建成[24]。根中转录因子和会响应磷饥饿而显著上调表达[30]。这些研究结果表明，及其靶基因家族成员，可以直接或间接地作为发育与响应非生物逆境之间的一个感应子或者连接体，发挥重要的功能。

生长素是植物体内重要的生长发育调控因子，各种来自外界的逆境均可以影响其在植物体内的稳态和转运，从而影响植物的生长发育[31]。本研究发现拟南芥的表达发生变化会影响莲座叶的生长，并且这种作用是通过生长素信号途径介导的，从而发现了一个新的调控功能。这种调控功能在蔬菜类作物中展现了应用前景。但是，miRNA都是通过对靶基因的调控实现其功能，本研究中如何通过其靶基因NF-YA家族调控了生长素途径还需要进一步研究分析。另外，在前期研究中发现也参与拟南芥开花时间的调控，那么生长素是否也介导了这一生物学过程？是如何协调介导叶片发育和开花时间的调控等问题，都值得进一步探讨。

4 结论

通过介导生长素信号途径参与了拟南芥叶片发育的调控，表达量发生变化会影响叶片的数量和大小，最终影响整个植株的生物量。

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（责任编辑 李莉，岳梅）

Molecular regulation mechanism of leaf development mediated by ath-miR169d in

ZHANG Min1, ZHU Ming1,2, LI WenZong1, MA Jie3, LIU YuePing3, JIANG HaiYang2, WANG Lei1, XU MiaoYun1

(1Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;3Colloge of Biological Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)

【Objective】The aims of this study are 1) to analyze the role of ath-miR169d in the progress of leaf development in, 2) to illuminate the mechanisms of molecular regulation mediated by ath-miR169d, and 3) to provide a new insight into improving the photosynthetic performance and the genetic engineering of vegetables biomass and crop productivity.【Method】Ath-miR169d over-expression transgenic plants, STTM ath-miR169d knockdown transgenic plants, and WT plants were grown in a controlled culture room at 22℃ with a relative humidity of 60% and 16 h/8 h photoperiod. Number and size of rosette leaf were measured; pmiR169d::GUS vector were constructed and transformed intoEHA105, and then infected the buds of wildtype(Columbia, Col-0), the pmiR169d::GUS transgenicplants were used to observe the expression profile ofin different organs and tissues by GUS staining method. Using 8-week-old seedlings ofover-expressing transgenicand wild type plants as materials, morphology of leaf epidemic cells were observed by scanning electron microscope (SEM). Whole shoots were harvested from 4-week-old seedlings ofover-expressing transgenicand wild type plants, subsequently the total endogenous IAA were detected and quantified as methyl esters by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS). The mRNA expression profiles were detected by microarray analysis to screen differentially expressed genes. The expression of key genes in plant auxin signal pathway were verified by real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR). 【Result】In contrast to WT, ath-miR169d overexpression plants exhibited fewer and smaller rosettes, STTM ath-miR169d knockdown plants showed more and larger rosettes. Moreover, STTM ath-miR169d plants could generate new rosette leaves incessantly even after bolting and seeds harvest, whereas the leaves of ath-miR169d overexpression and WT plants generally decayed after harvest. The epidermal cells in the leaves ofath-miR169d over-expression plants were smaller than that in the WT leaves by SEM detection. Ath-miR169d was highly expressed in SAM and leaf vasculature, and expression profile was stronger in new leaves than in old ones. Endogenous IAA content reduced by 38.6% in ath-miR169d over-expressing plants compared to wild-type plants, showingwas potentially involved in auxin signal pathway by microarray analysis. The auxin biosynthesis geneand transporter genewere downregulated inover-expressing plants whereas, auxin response factors 1 and 2 (and) genes were upregulated. Expression profile of,,andSTTMplantswere opposite to over-expressing plants. 【Conclusion】Results of the experiment showed that the leaf development was regulated by ath-miR169d through the auxin-signaling pathway. Number and size of rosette could be alerted by ath-miR169d expression level, and further affected biomass of the whole plant.

; miR169; leaf; development; auxin signaling pathway

2017-02-13；接受日期：2017-04-05

国家自然科学基金（31270318）、国家“973”计划（2014CB138205）

张敏，Tel：13126532159；E-mail：13126532159@163.com。通信作者徐妙云，E-mail：xumiaoyun@caas.cn