长期有机无机肥配施对东北黑土真菌群落结构的影响

丁建莉，姜昕*，马鸣超，关大伟，赵百锁，魏丹，曹凤明，李力，李俊*

（1中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京100081；2农业部微生物产品质量安全风险评估实验室，北京100081；3黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所，哈尔滨150086）

长期有机无机肥配施对东北黑土真菌群落结构的影响

丁建莉1,2，姜昕1,2*，马鸣超1,2，关大伟1,2，赵百锁2，魏丹3，曹凤明1,2，李力1,2，李俊1,2*

（1中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京100081；2农业部微生物产品质量安全风险评估实验室，北京100081；3黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所，哈尔滨150086）

【目的】分析长期有机无机肥配施对土壤真菌丰度、多样性及其群落特征的影响，探讨东北黑土真菌群落变化与施肥的相关性，为进一步调节土壤微生物结构，改善其生态功能提供参考依据。【方法】依托黑龙江省农业科学院36年长期定位试验站，选取4个不同施肥处理：不施肥处理(CK)、有机肥处理(M)、氮磷钾无机肥处理(NPK)和有机肥配施无机肥处理(MNPK)的耕作层土壤为研究对象，以真菌ITS基因为分子标靶借助qPCR技术和Illumina Miseq高通量测序平台，研究不同施肥处理对黑土中真菌群落丰度、多样性和组成的影响，并与土壤化学性质进行偶联分析，揭示群落与施肥的相关性。【结果】长期施用无机肥显著降低土壤pH，而有机无机配施可以有效缓解土壤酸化。NPK处理的ITS基因丰度显著高于MNPK；MNPK处理的细菌/真菌比值(26.91×104)显著大于NPK，各处理比值由高到低为MNPK>M>CK>NPK。细菌/真菌比值与土壤pH正相关；MNPK处理的真菌α多样性指数值略大于NPK。Ascomycota和Zygomycota为土壤中主要真菌门，不同施肥处理之间真菌组成的相对丰度存在显著差异，对照处理Ascomycota的相对丰度为45.35%，MNPK和NPK处理分别为50.93%和56.16%。有机肥有利于降低病原真菌相对丰度，具有高度侵染性的Cochliobolus在MNPK (0.41%)和M(0.39%)中的相对丰度显著小于CK(3.25%)和NPK(2.08%)。CCA分析表明，土壤理化性质共解释土壤真菌群落结构变化的73.3%，有效磷(贡献量为32.4%，P=0.002)、铵态氮(贡献量为14.8%，P=0.01)和硝态氮(贡献量为16.2%，P=0.048)是3个重要的影响因子。【结论】不同施肥条件下土壤真菌丰度、多样性，以及菌群组成特征不同。与无机肥相比，有机肥无机肥配施能够有效改善真菌群落结构，降低真菌的丰度，增加真菌多样性，并提高土壤pH，减缓土壤酸化。土壤有效磷、铵态氮和硝态氮含量是影响黑土土壤真菌群落结构变化重要因素。

施肥；真菌群落；高通量测序；土壤有效磷；土壤铵态氮；土壤硝态氮

黑土有机质含量高、土质肥沃，是最宝贵的土壤资源。我国东北黑土作为世界四大黑土区之一，面积达103万km2、占全国陆地总面积的10.7%，其中耕地面积3000万hm2、占全国耕地总面积的22.2%[1]，因此东北黑土在保障国家粮食安全、区域生态环境安全和农业可持续发展中具有不可替代的地位。然而由于长期不合理施肥导致土壤质量退化，如长期施用无机肥使得黑土土壤侵蚀严重、土层变薄、有机质含量下降、土壤酸化、土壤微生物活性降低等一系列问题[2–3]。而施用有机肥是提高作物产量、增加土壤有机质和改善土壤生物学性状的有效措施[4–5]。但近五十年来我国有机肥使用量持续下降，调查数据表明，在1960、1980、2000、2010年我国有机肥施用量占总施肥量的80%、60%、30%、10%[6]。面对无机肥施用量增加，有机肥施用量逐年减少的现状，我国提出了有机无机肥配施的施肥指导策略。研究土壤微生物生物量、群落组成等对施肥、耕作等措施的快速响应变化，可以指示土壤质量变化[7]。

关于施肥对土壤微生物影响的研究报道很多，有机肥与无机肥配施会提高土壤微生物生物量碳氮、土壤酶活[8]。真菌作为土壤微生物中的重要组成部分，在土壤生态中具有不可忽视的地位，与土传病害、植物互作、分解有机物质等密不可分[9–10]，因此探究施肥对土壤真菌的影响具有重要意义。研究表明施入氮肥会降低真菌的生物量[11]，降低多样性和改变真菌的组成结构[12–13]；相对细菌来说，真菌有更强的吸收氮素和磷素的能力[14]。无机肥减少菌根真菌的生长，而粪肥增加菌根真菌的生长[15]。施有机肥土壤理化性质与常规农田没有显著差异，但生物量高于常规农田，且菌根真菌量增加[16]。在温室试验中发现，生物有机肥可以降低土壤真菌的数量，尤其是病原真菌的数量，降低作物病害发病率，且改变真菌的组成结构[17]。高通量测序技术可进行环境中所有微生物群落的研究，获得数据量大，能更真实地揭示微生物群落的复杂性和多样性，极大的促进环境中不可培养微生物以及痕量菌的更深入研究[18–19]。本课题组的Zhou等[20]借助高通量测序技术研究不同施氮量和不同量氮、磷肥配施对东北黑土真菌群落结构变化的影响，发现氮肥和氮、磷肥配施可增加真菌数量，降低真菌多样性，改变真菌群落结构的组成。本研究首次应用高通量测序技术研究长期有机肥无机肥配施条件下东北黑土真菌群落结构是如何演变的，及其与土壤理化性质的偶联关系。

真菌核糖rDNA内部转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列分析技术已被应用到物种属内、近缘属间乃至科内研究系统进化关系[21]。由于ITS的序列分析能实质性地反映出属间、种间的碱基对差异，且序列片段较小、易于分析，目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中[22]。本研究选取4个施肥处理，探讨长期有机无机配施和单施无机肥条件下，真菌微生物丰度、多样性和组成的演变规律，及其与土壤理化性质的偶联关系。借助qPCR技术和Illumina Miseq高通量测序平台，以真菌ITS基因为分子标靶探讨以上问题。研究结果将为东北黑土建立合理施肥制度，维持土壤肥力，调节土壤微生物结构，改善其生态功能提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在黑龙江省农业科学院长期定位试验站进行，试验站位于黑龙江省哈尔滨市(45°40'N，126°35'E)，地势平坦，属于松花江二级阶地，海拔151m，无霜期135d，年均气温3.5℃，年降水量533mm。该试验站1979年成立，自次年起，按小麦–大豆–玉米顺序轮作，2015年为玉米季。本文选取4个施肥处理：不施肥处理(CK)；有机肥处理(M)；施氮肥、磷肥和钾肥的无机肥处理(NPK)；有机肥配施无机肥处理(MNPK)。每个处理3个重复。氮、磷、钾肥分别为尿素、重过磷酸钙、硫酸钾。氮、磷、钾肥小麦季和玉米季施用量为N150kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O75kg/hm2；大豆季施用量为N75 kg/hm2、P2O5150kg/hm2、K2O75kg/hm2。有机肥为马粪，施用量为18600kg/hm2。基础土壤理化性质(1980年)：pH7.22、有机质含量26.7g/kg、全氮1.47g/kg、全磷1.07g/kg、碱解氮151.1mg/kg、速效钾200mg/kg、有效磷51.0mg/kg。

1.2 样品采集

玉米收获季(2015年9月)取5—25cm的耕层土壤，在每个小区随机抽取10个点取样，去除土壤中杂草石块等杂质，混合均匀作为该处理的一个平行样品，每个处理3个重复。土壤样本保存于封口塑料袋中，一部分于温室风干、研磨后过0.2mm筛，用于测定土壤理化性质(用鲜土测定土壤铵态氮和硝态氮含量)；另一部分样品保存于–80℃冰箱，用于微生物群落分析。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤理化性质测定以下土壤理化性质参照鲁如坤[23]方法，采用酸度计法(土水比为1∶1)测定土壤pH；采用半微量凯氏定氮法测定土壤全氮；Olsen法测定土壤有效磷；采用乙酸铵浸提—原子吸收分光光度法测定土壤速效钾；通过重铬酸钾—容量法—外加热法测定土壤有机质。全自动流动分析仪(AA3)测定硝态氮和铵态氮的含量[24]。

1.3.2 土壤DNA的提取和ITS基因的高通量测序使用美国MOBIO公司的Power Max Soil DNA Isolation Kit试剂盒提取土壤总DNA，准确称取0.25g土壤样品，依据试剂盒说明书方法提取土壤总DNA。为了使土壤总DNA具有重复性和代表性，每个处理的每个重复样品，提取6次DNA，把所提取的6次DNA混合均匀作为该重复土壤总DNA进行后续实验[25]。用核酸定量仪(NanoDrop ND-1000)检测土壤总DNA浓度和纯度。符合要求的DNA送至北京奥维森基因科技有限公司应用Illumina MiSeq平台进行测序。

测序引物为ITS1F/ITS2(ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′,ITS2:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[26]。Illumina Miseq平台测序的主要步骤：首先合成带有barcode的特异引物，并使用Qubit荧光定量系统对PCR产物进行定量检测。再依据每个样本的测序量要求以及定量结果进行相应比例的混合。然后将含有标签的接头与DNA片段链接。选择性地富集两端连有接头的DNA片段，扩增DNA文库，使用测序平台对真菌ITS1区基因进行测序。原始序列上传至NCBI的SRA数据库编号为SRP085784。

1.3.3 定量PCR分析采用SYBR Green定量PCR分析ITS基因，反应在ABI7500Real-time PCR (ABI，USA)仪器上进行。反应体系为FastFire qPCR PreMix(TIANGEN，China)10μL，ROX Reference Dye0.4μL，1μL DNA模板，10nmol/L引物，补加ddH2O至20μL。真菌定量PCR引物为ITS4/ITS5

(ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′,ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)[27]。以含有目标基因的重组pGEMR-T载体为标准质粒，制备质粒和后续方法参照文献[28]。细菌16S rRNA基因丰度检测方法同真菌，其引物为515F/806R[29]。

1.3.4 高通量测序数据分析通过Illumina MiSeq平台进行Paired-end测序，使用Trimmomatic软件修剪数据末端碱基，以Q20≥90的标准用Readfq (vertion6.0)软件将低质量的成对reads过滤掉；采用FLASH(version1.2.10)软件把成对的reads通过其overlap拼接到一条序列，拼接的错误匹配率为0.1。Mothur(version1.31.2)软件去除长度小于200 bp的序列和maxhomop大于10的序列，并去除嵌合体。QIIME(v1.8.0)软件将拼接过滤后的序列聚类为用于物种分类的OTU(Operational Taxonomic Units)，OUT相似性设置为97%。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，对OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平统计每个样品的群落组成，对比UNITE数据库。利用软件Mothur进行α多样分析。采用SPSS19.1软件进行单因素ANOVA分析和Pearson相关性分析，并用Turkey显著差异法分析处理间的差异显著性。使用PAST软件，基于Bray-Curtis相似距离，对黑土中真菌群落结构进行聚类分析[30]。采用CANOCO5.0将土壤理化性质和真菌群落组成进行典范对应分析(CCA)。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理土壤理化性质

由表1可知，与不施肥相比，单施无机肥降低了土壤pH，施有机肥提高了pH，NPK处理的土壤pH值比CK降低0.53，MNPK的pH要高出NPK处理0.40。有机无机配施和单施无机肥处理极显著增加土壤中全氮、硝态氮、有效磷和有机质等的含量(P<0.05)，MNPK处理的有效磷含量较CK处理提高60.14mg/kg，NPK处理也较CK处理提高57.81 mg/kg；而施肥对不同处理的铵态氮、速效钾含量影响不显著。总体上来说，施肥改变了土壤理化性质。

表1 不同施肥处理对黑土土壤理化性质的影响分析Table 1 Variations of soil physicochemical properties under different fertilizer treatments

2.2 不同施肥处理的黑土ITS基因丰度和细菌/真菌比值分析

通过qPCR检测黑土中ITS基因和16S rRNA基因丰度，分析黑土土壤中真菌丰度，以及细菌/真菌比值(16S rRNA基因丰度值与ITS基因丰度值做商)，结果见图1。各处理ITS基因拷贝数为1.66×105～3.04×105/g,soil)，NPK处理的最高(3.04×105/g,soil)，比MNPK处理(2.02×105/g,soil)的高出1.02×105/g, soil，不同处理之间存在显著差异。通过分析细菌/真菌比值可知，MNPK处理(26.91×104)和M处理(23.61×104)均高于CK(19.58×104)，而NPK处理(9.90×104)小于CK。另外，通过土壤理化性质和ITS基因丰度，以及细菌/真菌比值的相关性分析(表2)可知，ITS基因拷贝数同铵态氮和速效钾含量显著正相关；细菌/真菌比值同土壤pH值显著正相关，与铵态氮含量显著负相关。

2.3 真菌 α 多样性分析

不同施肥处理之间的真菌α多样性分析结果(表3)表明，只有Observed Species分析，CK处理的最高(735)，与其他3个处理差异达到显著水平，3个施肥处理间虽有差异，但未达显著水平。Chao1、PD whole tree和Shannon指数，所有处理间均没有显著性差异。

2.4 不同施肥处理的黑土土壤真菌组成分析

由图2中可以看到，长期施肥的黑土土壤中检测到6个真菌门，相对丰度大于1的有5个，分别为：Ascomycota(相对丰度35.47%～56.22%)，Zygomycota(18.37%～25.66%)，Basidiomycota (8.26%～12.14%)，Glomeromycota(1.19%～2.63%)，Chytridiomycota(1.96%～9.87%)。相对丰度大于1%的菌纲有10个和相对丰度大于0.1%的菌属40个(图2)。

不同施肥处理土壤5个真菌门Ascomycota、Zygomycota、Basidiomycota、Glomeromycota和Chytridiomycota的相对丰度存在差异(图3)。CK处理Ascomycota的相对丰度为45.35%，M处理的为35.47%，而MNPK处理和NPK处理的分别提高到50.93%和56.16%。Zygomycota的相对丰度在CK处理为20.91%，在M处理比CK增加了4.75%，而在MNPK处理和NPK处理分别减少为18.37%和19.95%。可见长期施肥引起了真菌优势菌门相对丰度的差异。

图1 施肥处理ITS基因丰度和细菌/真菌比值的qPCR结果Fig. 1 The abundance of fungi as indicated by the number of ITS copies and bacteria-to-fungi ratio in different treatments analyzed by qPCR

表2 ITS基因拷贝数、细菌/真菌比值与土壤理化性质Pearson相关性分析Table 2 Pearson correlation coefficients between ITS gene sequence copy numbers, bacteria-to-fungi ratio and soil physiochemical characteristics

表3 不同施肥处理黑土土壤中真菌 α 多样性指数Table 3 α-diversity index of fungi under different fertilizer treatments

另外，不同施肥处理土壤真菌属水平组成分析(表4)，4个处理之间优势菌属Fusarium的相对丰度没有显著性差异；而Cochliobolus在CK处理和NPK处理中分别为3.25%和2.08%，在施入有机肥的MNPK处理和M处理中的相对丰度分别降低到0.41%和0.39%。Exophiala和Alternaria也有类似变化趋势，它们的相对丰度在NPK处理(分别为5.38%和2.49%)均显著高于MNPK处理(分别为3.15%和1.65%)。

2.5 不同施肥处理的聚类分析

聚类分析根据每个样品OTU的组成情况，更直观地展示各个样品之间的关系，组成越相似的样品，聚类关系越近。通过此分析，具有相似β多样性的供试样品聚类在一起，本研究各处理的结果(图4)显示CK处理的几个重复先行相聚，再同M和MNPK聚类，最后与NPK聚类。4个处理之间彼此分开，说明处理之间的群落结构存在差异；MNPK处理与NPK处理相比较，MNPK处理与CK处理的亲缘关系更近。

图2 长期施肥黑土土壤真菌组成Fig. 2 Fungal community composition in long-term fertilized soils

图3 不同施肥处理的真菌门水平相对丰度Fig. 3 Relative abundances of fungal common phyla under different long-term fertilizer treatments

表4 不同施肥处理黑土土壤中真菌属相对丰度 (%)Table 4 Relative abundances of fungal common genera under different treatments

图4 不同施肥处理黑土土壤中真菌组成聚类分析 (OTU水平)Fig. 4 Results of clustering analysis based on fungal community composition in different fertilized soils (at OUT-level)

2.6 CCA分析

CCA分析主要反映样品、菌群与环境因子之间关系。通过CCA分析长期不同施肥处理土壤中真菌群落与土壤理化性质之间的相互关系(图5)，本文选取的土壤理化性质包括：土壤pH、有机质、全氮、硝态氮、铵态氮、有效磷、速效钾等。土壤理化性质共解释土壤真菌群落结构变化的73.3%，前两轴累计解释量为56.53%，第一轴和第二轴的解释量分别为36.54%、19.99%。分析得知，对真菌群落结构解释量前三位的理化指标分别为：有效磷(贡献量为32.4%，P=0.002)、铵态氮(贡献量为14.8%，P=0.01)和硝态氮(贡献量为16.2%，P=0.048)。

3 讨论

3.1 长期施肥对黑土理化性质的影响

有机肥配施无机肥和单施无机肥处理极显著增加土壤中全氮、硝态氮、有效磷和有机质等的含量。总体上来说，施肥改变了土壤理化性质。对比4个处理1980年的土壤基础pH值(7.22)和施肥36年后的pH值，可知多年的施肥引起了土壤的严重酸化，应采取优化施肥措施缓解酸化。NPK处理的pH (5.89)明显低于CK、M和MNPK三个处理，说明施无机肥导致了土壤的酸化，而有机肥或者有机无机配施可以减缓土壤pH值的降低。酸性土壤pH因为施入粪肥而增加土壤pH，这可能是由于在粪肥中存在着大量的碳酸盐和碳酸氢盐[29,31]，另外，带有羟基和酚羟基的有机酸类在土壤中可以起到缓冲作用，而增加土壤pH[32]。

3.2 长期施肥对黑土中ITS基因丰度的影响

通过qPCR分析结果显示，不施肥的ITS基因丰度明显小于无机肥处理，显著大于单施有机肥，略高于有机无机配施。这些结果说明施用无机肥会提高土壤中真菌的数量，施用有机肥减少了土壤中真菌数量，而有机无机配施的真菌数量与不施肥处理无显著差异。因为真菌适应生存的pH范围较宽(pH 5～9)[33]，且较低的pH相对更有利于真菌的繁殖生长[34]，通过土壤pH分析得知，施用无机肥明显的降低了土壤pH，4个处理中施无机肥的土壤pH最低，所以施无机肥的真菌数最高。有机无机配施相对单施无机肥来说，可减缓土壤pH降低，所以土壤真菌含量相对较低。通过ITS基因拷贝数与土壤理化性质Pearson相关性分析，可知ITS基因拷贝数与土壤中的铵态氮含量显著正相关，这个结果与Zhou等[20]在研究氮肥对真菌丰度影响时得到的结论一致。

图5 不同施肥处理黑土土壤中真菌群落与土壤理化性质的CCA分析Fig. 5 Relationship between dominant soil fungal communities and soil chemical characteristics presented by CCA

3.3 长期施肥对黑土中细菌与真菌比值的影响

本文研究发现长期施用有机肥或者有机无机配施会提高黑土土壤中细菌/真菌比值(MNPK处理的为26.91×104)，施无机肥(NPK处理的为9.90×104)会降低细菌/真菌比值。这种比值变化是因为土壤pH与细菌数量有相关性[35]，pH值较低时，细菌数量较小；无机肥处理的pH明显小于有机无机配施处理，分析可知长期施用无机肥会降低黑土土壤中细菌数量，而有机无机配施会提高土壤中细菌数量(MNPK处理的16S rRNA基因拷贝数比NPK的高出2.40×1010/g,soil)。另外一个原因是pH值越低越有利于真菌的生长[34]。综合长期施肥而使得细菌数量和真菌数量的变化，发现长期施用无机肥导致黑土由“细菌型”向“真菌型”转变，而有机无机配施可以避免“细菌型”向“真菌型”的转变。通过细菌/真菌比值和土壤理化性质Pearson相关性分析，可知其与土壤pH有正相关性。

3.4 长期施肥对黑土中真菌 α 多样性的影响

本研究发现虽然不施肥处理、无机肥处理、有机无机配施处理的真菌α多样性总体上没有显著性差异，但是有机无机配施相对于无机肥有略提高真菌的多样性，无机肥有略降低土壤真菌的多样性的趋势，这与Zhou等[20]发现长期施用无机氮肥会降低土壤真菌的α多样性相一致。而Lou等[36]通过PCRDGGE方法研究报道无机肥和有机肥均会显著增加真菌多样性，尤其是有机肥，结果的不同很可能是因为试验方法和土壤类型的差别。

3.5 长期施肥对黑土中真菌组成的影响

Ascomycota的相对丰度在不施肥处理(45.35%)，有机无机配施处理(50.93%)和无机肥(56.16%)处理中大于单施有机肥处理(35.47%)的相对丰度，说明Ascomycota对无论有机肥和无机肥均不稳定。有机无机配施处理和无机肥处理中Ascomycota的相对丰度增加，是因为土壤中施入含氮的肥料使土壤中氮含量相对高，而土壤中施入适量氮能增加Ascomycota的百分比[13]。Zygomycota的相对丰度在单有机肥处理中要高于不施肥、有机无机配施和单施无机肥处理，有机粪肥提高了土壤中Zygomycota的含量，Neher等[37]研究发现Zygomycota的相对丰度与粪肥具有相关性。Cochliobolus在不施肥处理和单施无机肥处理均有较高的相对丰度，而在施入有机肥的MNPK处理和M处理中均大幅度降低；Exophiala和Alternaria有类似变化趋势。通过门和属两个水平的相对丰度分析得知，长期施用有机肥和无机肥会改变土壤中真菌组成的相对丰度。

丝状子囊菌属Cochliobolus具有高度的侵染性，其病原菌种对宿主植物具有特异性[38]，引起作物病害，在M处理(0.39%)和MNPK处理(0.41%)含量均较低，而NPK处理(2.08%)比MNPK处理高1.67%，说明有机无机配施可以减少Cochliobolus的相对丰度，降低作物病害发生率。具有腐生性和病原性的真菌Exophiala[39]在无机肥处理中含量显著高于有机无机配施处理；虽然我们没有监测作物的发病情况，但从真菌的组成也可以初步分析得到有机肥无机肥配施具有潜在减少作物土传病害发生的作用。另外，通过土壤理化性质与真菌组成的CCA分析，可以知道土壤理化性质影响着土壤真菌群落结构，尤其是土壤的有效磷和铵态氮浓度是两个重要因素。影响真菌群落结构的主要理化性质均为速效养分，这可能是和土壤养分物质存在的形式有关系，土壤中养分物质存在形式又与地理环境、气候温度有相关性，例如，寒温带土壤中氮素化合物33%～42%的氮是以氨基酸形式存在，大约有10%的氨基酸水解成铵态氮[40]。

4 结论

本研究通过对36年连续施用有机肥和无机肥土壤中真菌群落特征的研究，发现连续施用无机肥会导致土壤酸化，改变真菌群落结构，降低土壤真菌的多样性；而有机肥无机肥配施减缓土壤酸化，提高土壤真菌的多样性。从长期有机无机配施对真菌组成影响的分析可知，长期有机无机配施的真菌组成结构更有利于降低土传病害发生率。长期施用无机肥已导致黑土中真菌的数量增加，致使土壤由“细菌型”转化为“真菌型”，而有机无机配施可以改变这种变化趋势。CCA分析明确有效磷、铵态氮和硝态氮是影响土壤真菌群落结构变化重要土壤理化因素，同时土壤细菌/真菌比值与土壤pH正相关。

[1]国家统计局黑龙江调查总队.2014年黑龙江统计年鉴[M].北京:中国统计出版社,2014. Heilongjiang survery office of national bureau of statistics of China. Heilongjiang statistical year book[M].Beijing:China Statistica Press,2014.

[2]Wei D,Yang Q,Zhang JZ,et al.Bacterial communities structure and diversity in ablack soil as affected by long-term fertilization[J]. Pedosphere,2008,18(5):582–592.

[3]Zhou J,Guan D,Zhou B,et al.Influence of34-years of fertilization on bacterial communities in an intensively cultivated black soil in northeast China[J].Soil Biology and Biochemistry,2015,90:42–51.

[4]陶磊,褚贵新,刘涛,等.有机肥替代部分化肥对长期连作棉田产量、土壤微生物数量及酶活性的影响[J].生态学报,2014,34(21): 6137–6146. Tao L,Chu GX,Liu T,et al.Impacts of organic manure partial substitution for chemical fertilizer on cotton yield,soil microbial community and enzyme activities in mono-cropping system in drip irrigation condition[J].Acta Ecologica Sinica,2014,34(21): 6137–6146.

[5]Zhao J,Ni T,Li J,et al.Effects of organic-inorganic compound fertilizer with reduced chemical fertilizer application on crop yields, soil biological activity and bacterial community structure in a rice–wheat cropping system[J].Applied Soil Ecology,2016,99: 1–12.

[6]Shen QR,Tan JF,Qian XQ.An introduction to soil and fertilizer [J].Beijing:Higher Education Press,2001:4–6,270–271.

[7]Krashevska V,Klarner B,Widyastuti R,et al.Impact of tropical lowland rainforest conversion into rubber and oil palm plantations on soil microbial communities[J].Biology and Fertility of Soils,2015, 51:697–705.

[8]刘益仁,郁洁,李想,等.有机无机肥配施对麦-稻轮作系统土壤微生物学特性的影响[J].农业环境科学学报,2012,31(5):989–994. Liu YR,Yu J,Li X,et al.Effects of combined application of organic and inorganic fertilizers on soil microbiological characteristics in a wheat-rice rotation system[J].Journal of Agro-Environment Science, 2012,31(5):989–994.

[9]Van der Putten WH,Klironomos JN,Wardle DA.Microbial ecology of biological invasions[J].International Society for Microbial Ecology,2007,1:28–37.

[10]Peršoh D.Plant-associated fungal communities in the light of meta’omics[J].Fungal Diversity,2015,75(1):1–25.

[11]Wallenstein MD,Mcnulty S,Fernandez IJ,et al.Nitrogen fertilization decreases forest soil fungal and bacterial biomass in three long-term experiments[J].Forest Ecology and Management,2006, 222(1–3):459–468.

[12]Edwards IP,Zak DR,Kellner H,et al.Simulated atmospheric N deposition alters fungal community composition and suppresses ligninolytic gene expression in anorthern hard wood forest[J].PLoS One,2011,6:e20421.

[13]Paungfoo-Lonhienne C,Yeoh YK,Kasinadhuni NR,et al.Nitrogen fertilizer dose alters fungal communities in sugar cane soil and rhizosphere[J].Scientific Report,2015,5:8678.

[14]Wu T.Can ectomycorrhizal fungi circumvent the nitrogen mineralization for plant nutrition in temperate forest ecosystems[J]. Soil Biology and Biochemistry,2011,43:1109–1117.

[15]Gryndler M,Larsen J,HrselováH,et al.Organic and mineral fertilization,respectively,increase and decrease the development of external mycelium of arbuscular mycorrhizal fungi in along-term field experiment[J].Mycorrhiza,2006,16(3):159–166.

[16]Mäder P,Fliessbach A,Dubois D,et al.Soil fertility and biodiversity in organic farming[J].Science,2002,296(5573):1694–1697.

[17]Lang J,Hu J,Ran W,et al.Control of cotton Verticillium wilt and fungal diversity of rhizosphere soils by bio-organic fertilizer[J]. Biology and Fertility of Soils,2011,48(2):191–203.

[18]Kiely PD,Call DF,Yates MD,et al.Anodic biofilms in microbial fuel cells harbor low numbers of higher-power-producingbacteria than abundant genera[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2010,88(1):371–380.

[19]Shokralla S,Spall JL,Gibson JF,et al.Next-generation sequencing

technologies for environmental DNA research[J].Molecular Ecology,2012,21(8):1794–1805.

[20]Zhou J,Jiang X,Zhou B,et al.Thirty four years of nitrogen fertilization decreases fungal diversity and alters fungal community composition in black soil in northeast China[J].Soil Biology and Biochemistry,2016,95:135–143.

[21]陈剑山,郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用[J].安徽农业科学,2007,35(13):3785–3786. Chen JS,Zheng FC.Application of ITS sequences in fungi classification and identification[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2007,35(13):3785–3786.

[22]燕勇,李卫平,高雯洁,等.rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用[J].中国卫生检验杂志,2008,18(10):1958–1961. Yan Y,Li WP,Gao WJ,et al.Application of rDNA ITS sequence analysis in fungus identification[J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology,2008,18(10):1958–1961.

[23]鲁如坤.土壤农业化学分析方法[M].北京:中国农业科技出版社, 1999:431–472. Lu RK.Soil and agricultural chemistry analysis[M].Beijing:China Agricultural Science and Technology Press,1999:431–472.

[24]马琳.玉米施氮量与土壤硝态氮、铵态氮的动态变化[D].哈尔滨:东北农业大学硕士学位论文,2015. Ma L.Nitrogen fertilizer rates on maize and the dynamic changes of nitrate and ammonium in soil[D].Harbin:Master Dissertation of Northeast Agricultural University,2015.

[25]Fierer N,Lauber CL,Ramirez KS,et al.Comparative metagenomic, phylogenetic and physiological analyses of soil microbial communities across nitrogen gradients[J].The ISME Journal,2012, 6:1007–1017.

[26]Orgiazzi A,Lumini E,Nilsson RH,et al.Unravelling soil fungal communities from different Mediterranean land-use back grounds[J]. PloS One,2012,7:e34847.

[27]Schoch CL,Seifert KA,Huhndorf S,et al.Nuclear ribosomal internal transcribed spacer(ITS)region as auniversal DNA barcode marker for fungi[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2012,109:6241–6246.

[28]Chinnadurai C,Gopalaswamy G,Balachandar D.Long term effects of nutrient management regimes on abundance of bacterial genes and soil biochemical processes for fertility sustainability in asemi-arid tropical Alfisol[J].Geoderma,2014,232:563–572.

[29]Ding JL,Jiang X,Ma MC,et al.Effect of35years inorganic fertilizer and manure amendment on structure of bacterial and archaeal communities in black soil of northeast China[J].Applied Soil Ecology,2016,105:187–195.

[30]周晶,姜昕,周宝库,等.长期施用尿素对东北黑土中氨氧化古菌群落的影响[J].中国农业科学,2016,49(2):294–304. Zhou J,Jiang X,Zhou BK,et al.Effects of long term application of urea on ammonia oxidizing archaea community in black soil in northeast China[J].Scientia Agricultura Sinica,2016,49(2): 294–304.

[31]Whalen JK,Chang C,Clayton GW,et al.Cattle manure amendments can increase the pH of acid soils[J].Soil Science Society of America,2000,64(3):962–966.

[32]GarcıÁ-Gil JC,Ceppi SB,Velasco MI,et al.Long-term effects of amendment with municipal solid waste compost on the elemental and acidic functional group composition and pH-buffer capacity of soil humic acids[J].Geoderma,2004,121(1–2):135–142.

[33]Rousk J,Bååth E,Brookes PC,et al.Soil bacterial and fungal communities across apH gradient in an arable soil[J].The ISME Journal,2010,4:1340–1351.

[34]Rousk J,Brookes PC,Bååth E.Contrasting soil pH effects on fungal and bacterial growth suggest functional redundancy in carbon mineralization[J].Applied and Environmental Microbiology,2009, 75(6):1589–1596.

[35]Ahn JH,Song J,Kim BY,et al.Characterization of the bacterial and archaeal communities in rice field soils subjected to long-term fertilization practices[J].Journal of Microbiology,2012,50(5): 754–765.

[36]Luo P,Han X,Wang Y,et al.Influence of long-term fertilization on soil microbial biomass,dehydrogenase activity,and bacterial and fungal community structure in abrown soil of northeast China[J]. Annals of Microbiology,2015,65:533–542.

[37]Neher DA,Weicht TR,Bates ST,et al.Changes in bacterial and fungal communities across compost recipes,preparation methods, and composting times[J].PLoS One,2013,8(11):e79512.

[38]Condon BJ,Leng Y,Wu D,et al.Comparative genome structure, secondary metabolite,and effector coding capacity across cochliobolus pathogens[J].PLoS Genetics,2013,9(1):e1003233.

[39]Yu L,Nicolaisen M,Larsen J,et al.Organic fertilization alters the community composition of root associated fungi in Pisum sativum[J]. Soil Biology and Biochemistry,2013,58(8):36–41.

[40]Sowden FJ,Chen Y,Schnitzer M.The nitrogen distribution in soils formed under widely differing climatic conditions[J].Geochim Cosmochim Acta,1977,41(10):1524–1526.

Structure of soil fungal communities under long-term inorganic and organic fertilization in black soil of Northeast China

DING Jian-li1,2,JIANG Xin1,2*,MA Ming-chao1,2,GUAN Da-wei1,2,ZHAO Bai-suo2,WEI Dan3,CAO Feng-ming1,2,LI Li1,2,LI Jun1,2*
[1 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 Laboratory of Quality &Safety Risk Assessment for Microbial Products (Beijing), Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China; 3 Institute of Soil Fertility and Environmental Sources, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China]

【Objectives】The abundance,diversity and composition of fungal community were identified,and the main relationship between soil fungi community variation and soil fertilizer would be revealed in this paper.【Methods】Based on36-years’fertilization experiment in Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,four treatments were selected to study:no fertilizer(CK);manure(M);chemical N,P and Kfertilizer(NPK); and manure with NPK(MNPK).The ITS gene was applied as target gene,using Illumina Miseq sequencing and quantitative PCR method.The fungal abundance,diversity and composition in black soil were analyzed.The relationship of fertilization and fungi community was calculated.【Results】Long term application of chemical fertilizers reduced soil pH and led to soil acidification,while manure did not show same impact.ITS gene abundance in ratio in MNPK(26.91×104)was significantly higher than that in NPK,and the ratio was in order of MNPK>M>CK>NPK.NPK treatment was more than in MNPK.Bacteria-to-fungi ratio was positively correlated with soil pH.Alpha diversity of fungi community of MNPK was slightly greater than that of NPK. Ascomycota and Zygomycota were the top two majority fungi found in black soil.The relative abundance of the fungi community was significantly different among the four fertilization treatments.The relative abundanceof Ascomycota in CK was45.35%,in MNPK and NPK were50.93%and56.16%,respectively.Manure reduced the relative abundance of pathogenic fungi.The relative abundances of highly aggressive Cochliobolus in MNPK (0.41%)and M(0.39%)were significantly lower than those of CK(3.25%)and NPK(2.08%).Canonical correlation analysis indicated that the selected soil properties could explain73.3%of the variation,and fungal communities were closely positively correlated with soil available P(Contribution=32.4%,P=0.002),NH4+-N concentration(Contribution=14.8,P=0.01)and NO3–-N concentration(Contribution=16.2%,P=0.048).【Conclusions】Long-term fertilization affects fungal abundance,diversity and community characteristics of black soil.Compared with chemical fertilizers,manure alone and manure combined with chemical NPK fertilizers will improve the fungal communities structures,decrease fungal abundance and increase diversity activity, enhance the soil pH,slowed down soil acidification.Among the soil fertility factors,the soil available P,NH4+-N and NO3–-N concentrations are the three dominant factors determining the variation of fungal communities structures.

fertilization;fungal communities;high-throughput sequencing;soil available P;soil NH4+-N; soil NO3–-N

2016–09–18接受日期：2017–03–01

国家自然科学基金项目（41573066）；国家“973”计划（2015CB150506）；农业微生物产品质量安全风险评估专项任务（GJFP201601202，GJFP201601203）；国家“863”计划（2013AA102802-04）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-04）资助。

丁建莉（1981—），女，辽宁凌源人，博士研究生，主要从事环境微生物与农业生态方面的研究。E-mail：lndjl@126.com *通信作者E-mail：jiangxin@caas.cn；E-mail：lijun01@caas.cn