补肾活血中药促成骨增殖靶效应抗骨质疏松的机制研究

林松青，王 彬，周 洁，陈 宇，范世珍

(1.广州中医药大学深圳医院，广东 深圳518000；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410000)

补肾活血中药促成骨增殖靶效应抗骨质疏松的机制研究

林松青1，王 彬1，周 洁2，陈 宇1，范世珍1

(1.广州中医药大学深圳医院，广东 深圳518000；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410000)

骨质疏松症(OP)是临床中常常遇见的骨疾病,是引起全身骨量降低的主要因素,进而导致骨微结构毁坏以及骨密度降低,增加骨脆性因而易于发生骨折[1]，严重者甚至威胁生命。目前西医临床用于治疗骨质疏松症的药物主要有雌激素、降钙素以及阿伦磷酸盐等药物，其临床疗效尚可，但副作用也多。研究表明[2]，人们随着年龄的增加，胃肠道、肝肾功能也随之衰退，老年人长期用药后容易导致药物在体内蓄积，副作用明显增大，且对治疗骨质疏松的疗效明显降低。中医治疗骨质疏松症主要从“肾主骨”论治，辅以活血，能够明显的缓解骨质疏松患者的临床症状及生活质量的提高。研究表明，补肾活血中药通过加快成骨细胞的增殖分化进而增快骨形成，但中药促进成骨，抑制骨吸收的效应与机制尚不完全清楚，研究发现NF-κB信号通路是其作用的重要靶点。NF-κB信号通路在成骨细胞分化、增殖及凋亡中有着关键的作用，同时还能介导骨组织的生长发育。本实验通过体外实验来分析NF-κB信号通路在补肾活血中药抑制骨吸收、促进骨形成过程中的作用机制，探讨NF-κB信号通路相关基因成骨分化的分子功能，从细胞分子学角度分析补肾活血中药防治骨质疏松症的科学依据及作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料 补肾活血方(主要成分为补骨脂、熟地、黄芪、山茱萸、当归)的提取药物，最后提炼制成中药冻干粉(康美药业公司提供)。成骨细胞由SD大鼠头盖骨分离培养；破骨细胞由四肢骨分离培养。

1.2 方法

1.2.1 成骨细胞的分离与培养 取一日龄SD大鼠麻醉下处死,以75%酒精浸泡15 min,取出头盖骨,以DMEM洗净、剪为1立方毫米大小的骨块,接着将附着软组织剔净,获取其细胞,再用PBS缓冲液冲洗,放于NCS-MEM培养液中培养,培养液浓度为10%。接着静置培养于37℃ 5%CO2中,时间间隔2天换1次培养液,弃去原培养液,然后于胎牛血清MEM中开始培育,培养液浓度为10%。直到单层细胞铺满培养瓶底,时间通常为4-7天。观察到细胞开始传代时,先把原培养液倒掉,然后选用D-Hank’s液对培养的细胞进行冲刷,消化选用0.25%胰蛋白酶,倒掉消化液后再倒入培养液,接着对培养瓶底进行吹打,促使细胞脱落,从而制成细胞悬液,最后接种于新的培养瓶,放置于37℃、5%CO2中静置继续培育。

1.2.2 破骨细胞的分离与培养 麻醉下取SD大鼠的四肢长骨,然后冲洗大鼠骨髓,过80目筛，移于试管中，加培养液混匀，取下2/3的培养液，用10%牛血清培养液培养，3 h后更换培养液， 2 d后再次更换培养液，持续培养。

1.2.3 成骨细胞-破骨细胞共育体系的创设 先对破骨细胞进行细胞计数,再对成骨细胞计数,用培养液调整成骨细胞数,使成骨细胞和破骨细胞数目之比为10∶1、100∶1,将其种植于24孔板中,用含有1mM的B-甘油磷酸钠培养细胞6h后,取成功培育的破骨细胞和成骨细胞进行贴面培养,收集成骨细胞,对细胞碱性磷酸酶的含量及活性进行检测并对细胞碱性磷酸酶染色。。

1.2.4 药物制备 用煎煮法以水为溶剂提取中药配方的有用成分，最后得到药材重量：中药水提液=1∶1～1∶1.5，冷却后，往水提液中一边放入无水乙醇一边搅拌至乙醇浓度为 50%-60%，静置6 h。抽滤，弃去沉淀，将滤液蒸发浓缩至稠膏状，真空干燥，得冻干粉。DMEM 培养基稀释成母液，放入培养基中干预细胞。

1.2.5 实验分组 按照细胞生长情况换补肾活血中药血清培养液；实验分A 组(诱导剂+中药血清低浓度组 50 μg/ml)、B 组(诱导剂+中药血清中浓度组100 μg/ml)、C组(诱导剂+中药血清高浓度组 200 μg/ml)、D组(空白对照组，培养液为完全培养基)、E组(诱导剂组：完全培养基加入地塞米松、维生素C、甘油磷酸)、F组(NF-kB信号通路的特异性抑制剂IKK-DN 组)。

1.2.6 DAPI染色法检测细胞凋亡 把用0.25%胰蛋白酶消化后的细胞分别放入10%含药血清培养7天,放入TNF-α,分别于12 h、24 h后选出长有成骨细胞的盖玻片,投入95%酒精固定15-30 min,微干,染色1 min。0.1M CaCl2处理2 min。用PBS漂洗几次,每次漂洗时间一般为持续3秒。紧接着用PBS封片,放置于Nikon荧光显微镜下直接观察并照相。

1.2.7 ELISA 法检测培养液中RANK浓度 干预培养48 h取培养液。每孔分别放入样品、样品稀释液，标准品各100 μl,37℃温育30 min后分别放入酶标偶合液、底物、终止液50 μl于450 nm波长读取OD值。样品、标准品均设复孔，每个样本重复1次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 成骨细胞鉴定

经形态学、Ⅰ型胶原免疫组化及碱性磷酸酶活性检测判定为成骨细胞。见图1。

A：形态学 B：Ⅰ型胶原免疫组化和碱性磷酸酶活性检测

2.2 破骨细胞鉴定

经酒石酸TRACP染色判定为破骨细胞。见图2。

2.3 成骨细胞-破骨细胞共育体系判定

显微镜下观察可见破骨细胞胞浆呈红色阳性反应，胞核呈阴性。见图3。

图2 破骨细胞鉴定

图3 成骨细胞-破骨细胞共育体系鉴定

2.4 补肾活血中药提高ALP活性

与空白对照组比较补肾活血中药低浓度组，诱导剂组明显提高ALP活性，抑制剂组明显降低ALP活性，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 补肾活血方对ALP活性的影响

注：与空白对照组相比，*P<0.05。

2.5 补肾活血中药减少细胞凋亡

DAPI染色是一种采用经典的DAPI进行细胞凋亡检测的快速简便的方法。在细胞发生凋亡的时候，染色质会浓缩，DAPI染色后在荧光显微镜下观看，正常细胞的细胞核一般呈蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈紧密浓染，或呈碎块状紧密浓染，同时颜色略显白色。

补肾活血方低、中、高浓度组明显减低细胞凋亡，诱导剂明显增加细胞凋亡，抑制剂明显减低细胞凋亡。见图4。

图4 细胞凋亡图

2.6 补肾活血中药升高RANK浓度

与空白对照组比较补肾活血方低、中、高浓度组、诱导剂组、抑制剂组均明显升高RANK浓度，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 补肾活血方对培养液RANK浓度的影响±s)

注：与空白对照组相比，*P<0.05。

3 讨论

依据骨质疏松症的病因病机和临床体征,其与传统医学中“骨枯”“骨痿”疾病症状相似。中医认为,补肾重在温补肾阳,填补肾精。补肾活血中药主要为补骨脂、熟地、黄芪、山茱萸、淫羊藿等组成,全方具有壮骨补肾,通络活血的作用。研究表明[3,4],方中中药淫羊藿的提取液对增长的矿化物没有作用,然而对去睾丸后骨高转化率能够有效控制。且该药对激素减少类骨质疏松(OP)具有明显防治作用,可抑制骨吸收。谢华[5]等经过对中药黄芪水提取液对防治大鼠类固醇性骨质疏松影响的观察,表明激素组骨吸收较黄芪水提取液组增高69%,同时新骨的形成降低100%,骨小梁面积减少27%,从而表明黄芪能明显防治类固醇性OP。史风芹等[6]发现高浓度的大黄可有效控制破骨细胞骨吸收,抑制破骨细胞在骨片上的侵蚀,使骨片上骨陷窝的数量明显减少,然后将高浓度的大黄稀释后,对破骨细胞在骨片上侵蚀的抑制性明显降低。国内外临床研究已证实,补肾活血中药能促进骨形成,抑制骨吸收[7，8],且可以明显改善骨质疏松症患者的症状[9]及缓解疼痛。

本实验研究结果证实，补肾活血中药能够增进成骨细胞的表达而有效控制破骨细胞的分化，通过实验组各组间对比，证实NF-kB信号通路在骨代谢中的作用是促进破骨细胞的分化而抑制成骨细胞的形成，这与以往临床研究的结果相一致[10]。研究已证实，OP的发生[11,12]是由于成骨细胞增殖分化的抑制或成骨细胞凋亡进程的加速，进而使骨形成少于骨吸收。NF-κB信号通路对成骨细胞的增殖分化以及凋亡过程都有着关键的作用。同时，破骨细胞对骨吸收和骨形成的动态平衡起着关键的作用，而NF-κB信号通路的活化被称为是成熟破骨细胞存活[13]和发挥功能[14]的关键调节因子。本研究发现，补肾活血中药低浓度组明显增高ALP活性，抑制剂明显减低ALP活性，与空白对照组对比差异均具有统计学意义(P<0.05)。补肾活血中药低、中、高浓度组明显增高RANK浓度，与空白对照组对比差异具有统计学意义(P<0.05)；抑制剂组明显增高RANK浓度。补肾活血中药低、中、高浓度组明显减低细胞凋亡，诱导剂明显增加细胞凋亡，抑制剂明显减低细胞凋亡，与空白对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。表明补肾活血中药可以提高ALP活性，减低细胞凋亡，增高RANK浓度，并通过调控NF-κB信号通路增进成骨细胞的表达而有效控制破骨细胞的分化，从而抗骨质疏松。

[1]王 鸥,邢小平.老年性骨质疏松症发病机制及药物治疗发展[J].中国实用内科杂志,2011,31(8):584.

[2]曹克勇,王倩芬,王旭明，等.复合脉冲电磁场治疗骨质疏松症的临床疗效观察[J].中国康复医学杂志,2014,29(2):168.

[3]李青甫，吴 铁，谢 华，等.淫羊藿提取液对去睾丸大鼠代谢的影响[J].中草药.1993，24(12)：637.

[4]李青甫，廖进民，吴 铁，等.淫羊藿提取液防治激素所致大鼠骨质疏松的实验研究[J].中国药学杂志.1996，31(8)：467.

[5]谢 华，吴 铁，李朝阳，等.黄芪水提取液对大鼠的类固醇性骨质疏松的防治作用[J].中草药.1997，29(1)：25.

[6]史风芹，于世凤，张润荃，等.大黄对破骨细胞性骨吸收作用的研究[J].现代口腔医学杂志.1995，9(3)：193.

[7]许 兵，陈如平，刘 慧，等.补肾活血中药对成骨细胞的影响[J].医学综述.2011，17(14)：2180．

[8]陈晓飞，陈素红，吕圭源，等.补肾活血方治疗骨质疏松症机制研究及探讨[J].中成药.2011，33( 7):1130．

[9]向科明，赖洪华，庄 琼，等.补肾活血法治疗绝经后妇女骨质疏松症 98 例临床观察[J].临床和实验医学杂志，2011，10(13):1044．

[10]李文锋，侯树勋，张伟佳，等.TNF-α-NF-κB对成骨细胞分化过程中BMP-2-Smad1信号通路的影响[J].中国骨质疏松杂志，2011，1(2):39.

[11]Xing L，Boyce BF.Regulation of apoptosis in osteoclasts and osteoblastic cells[J].Biochem Biophys Res Comun，2005；328(3):709.

[12]Jilka RL，Weinstein RS，Parfitt AM，et al.Quantifying osteoblast and osteocyte apoptosis：challenge and rewards[J].J Bone Miner Res，2007；22(10):1492.

[13]Miyazaki T，Katagiri H，Kanegae Y，et al.Reciprocal role of ERK and NF-kappaB pathways in survival and activation of osteoclasts[J].J Cell Biol，2000；148(12):333.

[14]Jimi E，Nakamura I，Ikebe T，et al.Activation of NF-kappaB is involved in the survival of osteoclasts promoted by interleukin-1[J].J Biol Chem，1998；273:8799.

2015年广东省中医药管理局课题( 20152063)，2015年深圳市科技研发资金基础研究资助项目 (JCYJ2015033109 0820169)

1007-4287(2017)08-1443-04

林松青，男，46岁，主任中医师，教授，硕导，从事中医骨伤研究.

2016-04-24)