CXCL12-G801A基因多态性在非小细胞肺癌中的表达及发病风险相关性研究

黄佳滨,隋小芳,王凤玲,袁博洋,刘 影,范巧菊

(佳木斯大学附属第一医院 老年病科，黑龙江 佳木斯154002)

*通讯作者

CXCL12-G801A基因多态性在非小细胞肺癌中的表达及发病风险相关性研究

黄佳滨,隋小芳*,王凤玲,袁博洋,刘 影,范巧菊

(佳木斯大学附属第一医院 老年病科，黑龙江 佳木斯154002)

肺癌是多基因以及多因素参与的疾病，发病机制还有影响预后的因素还不够明确，诊断以及治疗技术仍然需要改进。其中非小细胞肺癌占全部肺癌患者的比例>80%，但是该病患者的5年生存率只有10%左右[1]。虽然非小细胞肺癌患者的预后判断依据主要是组织学类型以及临床分期，不过有着相同特点的该病患者应用相同的治疗措施，预后质量可能存在很大的区别。这就需要进一步探讨该病发病风险。在肿瘤发生发展的过程当中，趋化因子发挥着重要的影响，部分趋化因子可以刺激肿瘤增殖，加速血管的形成，从而使得肿瘤细胞移动并且粘附到内皮细胞当中，实现肿瘤的转移与扩散。另一部分趋化因子可以控制肿瘤血管以及肿瘤细胞的形成，激发机体的特异性免疫应答，有效预防肿瘤转移与生长[2]。本研究选取非小细胞肺癌患者以及健康人群，对比CXCL12-G801A基因多态性在两组对象当中的区别，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月到2013年1月我院收治的NSCLC患者中408例为研究组，均未进行放化疗，同时选取同期健康体检人员303例为对照组，同研究组对象之间不存在血缘关系。两组研究对象均知情同意，并且经过医院伦理委员会批准。收集两组研究对象的性别、年龄以及吸烟史等资料，两组患者一般资料有可比性(P>0.05)，见表1。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器及试剂。主要仪器：压力灭菌器(美国MILLIPORE公司)、超纯水仪(上海任氏电子公司)、Diagnostics酶标仪(美国MILLIPORE公司)、L420低速离心机(湘仪离心机公司)、基因扩增仪TC-XP(德国Bioer公司)、电泳槽DYC-31D(北京六一厂)。主要试剂：限制性内切酶(上海Sangon公司)、PCR引物(上海Sangon公司)、dNTP(美国MILLIPORE公司)、琼脂糖(BBI公司)、Taq DNA聚合酶(美国Invitrogen公司)。

1.2.2 样本采集方法。两组研究对象在无菌条件下采集5 ml静脉全血，加入构椽酸钠试管当中混匀，冰箱保存备用，其中保存的时间应当<7 d，提取血细胞的DNA[3]。

1.2.3 DNA提取方法。取出标本并在室温条件下解冻，吸取1 000 μl的血液放入到EP管当中，在血液当中添加1 000 μl Tip并且充分混匀，之后3 000 r/min持续分离5 min之后弃上清。重复进行该步骤，如果血样仍为红色需要继续重复。如果沉淀为淡红色使用200 μl的TE悬浮[4]。添加500 μl的Cell lysis solution到样本当中充分混匀，添加5 μl的Pro tein K之后在60℃条件下孵育10 min。使用70%的乙醇沉淀颗粒，在空气当中干燥5 min，从而溶解DNA颗粒到纯水当中保存[5]。

表1 两组研究对象一般资料比较(例，%)

1.2.4 DNA鉴定方法。将提取得到的基因组DNA，在脂糖凝胶当中电泳30 min之后，将凝胶转移到像系统下完成观察，溶解DNA使用蒸馏水根据比例稀释到100 ng/ul，震荡器持续震荡30 s之后离心备用，作为PCR反应当中的DNA模板[6]。

1.2.5 PCR扩增方法。PCR反应体系是25μl，离心混匀之后置入PCR扩增仪。2%的琼脂糖凝胶电泳用来鉴定PCR扩增产物，将特异性内切酶置于恒温箱当中消化2 h，使用2%的琼脂糖凝胶电泳来分析结果。

1.2.6 PCR产物分析方法。将制备得到的胶板置入水平电泳槽，使用稀释的1xTAE液。吸取2 μl扩增产物之后加样到琼脂糖凝胶电泳，同时加样阴性对照(未添加DNA模板)及阳性对照(稳定PCR产物)。通电之后稳压在100 V，设定电泳的时间为10 min。电泳完成之后取出凝胶，在紫外灯下同Marker条带对比，从而确定扩增片段的长度，使用PCR-RFLP法实现CXCL12-G801的基因分型[7]。

1.3 统计学方法

检测数据用SPSS18.0分析，采用卡方检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

CXCL12-G801A同非小细胞肺癌的发病风险关系方面，两组研究对象的 G/G基因型、A/A基因型以及A/G基因型频率对比无明显区别(P>0.05)，见表2。

表2 CXCL12-G801A同非小细胞肺癌的发病风险的关系(例，%)

CXCL12-G801A等位基因分布同非小细胞肺癌的易感性联系方面，两组研究对象的多态性等位基因频率对比无明显区别(P>0.05) ，见表3。

表3 XCL12-G801A等位基因分布同非小细胞肺癌病理分期的关系

3 结论

肺癌患者当中绝大多数属于非小细胞肺癌，因为该病的早期诊断率比较低，导致患者在临床确诊之后已经错过最佳手术时机，所以放化疗成为治疗非小细胞肺癌晚期患者的常用方法[8]。有研究人员发现非小细胞肺癌患者化疗的效果以及预后生存同基因变异以及表达水平存在联系。非小细胞肺癌患者的预后质量较差，主要是因为该病在长段时间内缺乏典型的临床症状，患者在确诊之后己经属于晚期，难以进行手术治疗[9]。临床实践显示，有着类似临床特征并且采取相同治疗措施的患者，生存时间也可能存在区别。这一方面同患者的个体体质存在联系，另一方面也受遗传变异等因素的潜在影响。

趋化因子CXCLl2作为基质衍生因子的一种，在淋巴细胞发育、肿瘤发生发展、免疫炎症调节以及血管生成等领域都有着不容忽视的重要影响。在编码CXCLl2基因转录区存在801位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)的多态性，也就是CXCLl2-G801A。研究人员最初克隆小鼠骨髓的基质细胞，其中鼠以及人体的CXCLl2有氨基酸序列相同程度>99%。人体当中的CXCLl2-G801A主要是骨萌基质细胞以及组织间质细胞进行分泌，同时在肺、脑、骨骼以及肝脏等多种细胞以及组织当中都有表达[10]。CXCLl2属于高效淋巴细胞以及单核趋化因子，在人体造血干细胞归巢骨髓的过程当中有着重要的作用。CXCLl2借助于同受体结合而发挥生物学功能，可以同CXCLl2进行结合的相关趋化因子受体主要是CXCR4以及CXCR7。相关研究的结果显示，CXCR7在人体肿瘤转移以及肿瘤侵袭的过程当中都有重要的影响。近年来最新研究结果显示肌肉瘤细胞当中的CXCR7表达要显著高于CXCR4，二者同正常横纹肌细胞对比均呈现出高表达状态[11]。

研究显示CXCLl2-G801A基因位点多态性同HIV感染、哮喘以及自身免疫疾病存在一定的联系。人类CXCLl2一共包括6种基因型，在转录的过程当中剪切方式的不同导致不同种型形式的出现。CXCLl2-G801A基因的变异位于CXCLl213基因片段，往往会影响到CXCLl213的产生量。研究人员最早发现这一多态性影响到HIV患者的感染进程[12]。G/A杂合子能够明显延缓HIV患者疾病的发展进程，同时A/A纯合子HIV患者的生存时间往往比较长，同时是暴露在HIV病毒当中的发病时间也显著延迟。体外研究的结果显示，CXCLl2-G801A的多态性保护效果主要是借助于稳定CXCLl2RNA，增加CXCLl2-G801A的表达而实现的。CXCLl2保护效果在自身免疫脑脊髓炎相关动物模型当中也得到证实。本研究的结果显示，研究组以及对照组的吸烟个体比例是39.0%以及36.6%，两组研究对象之间不存在明显的区别(P>0.05)，推测同样本数量比较有限存在联系。研究组当中存在家族肿瘤史以及不存在家族肿瘤史的个体比例是78.7%以及21.3%，两组比较无明显区别(P>0.05)。研究组以及对照组研究对象的CXCLl2-G801A 3种不同基因型(G/G，G/G以及G/A)的频率分别为56．0%、4.9%、39．1%以及73．3%、3.0%以及23．7%。两组患者3种基因型之间的分布对比，无明显的区别(P>0.05)。研究组还有对照组研究对象的CXCLl2-G801A的G/G基因型分布频率是59.6%以及66.4%，研究组以及对照组的研究对象CXCLl2-G801A的A/G频率是30.2%以及25.7%。A/G基因型以及G/G基因型对比而言，两组研究对象之间的基因型分布无明显区别(P>0.05)，G/A基因型以及G/G基因型对比而言，两组研究对象的基因型分布无明显区别(P>0.05) 。研究组以及对照组研究对象G/A基因的分布频率是72.2%。75．9%以及27．8%、24．1%，G/A基因的频率分布无明显区别(P>0.05) 。本研究采用研究组以及对照组的对比研究，不过本实验的研究组以及对照组研究对象均来自于我院，受种族、地域、样本数量、环境以及个体差异等方面因素的影响，本研究只针对CXCLl2-G801A位点以及家族史、吸烟史等危险因素进行分析，存在一定的局限性。这是因为多个危险因素彼此之间可能会发生相互影响，从而生成不同的效果，所以CXCLl2-G801A的基因多态性同非小细胞肺癌的发病风险仍然需要深入的研究。

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2016-07-20)