Caspase-3蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义

曹斌校

Caspase-3蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义

曹斌校

目的：探讨含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)蛋白在人结直肠癌组织中的表达及其临床意义。方法：采用免疫组织化学SP法检测48例肠癌组织及配对癌旁组织中Caspase-3蛋白表达水平，并探讨其表达水平与临床病理学特征及预后的关系。结果：Caspase-3主要表达于胞浆，其在肠癌组织中的阳性表达率为27.08%，癌旁组织阳性率为58.33%，癌组织显著低于癌旁组织(P＜0.05)；Caspase-3阳性表达与肿瘤分期(P＜0.05)和病理分级(P＜0.05)有关。Caspase-3阳性患者中位无疾病进展生存时间为32.4个月，阴性患者为24.8个月(P＞0.05)。结论：Caspase-3蛋白在人结直肠癌组织中表达率较低，可能结直肠癌的发生发展有关。

结直肠癌；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶；免疫组织化学；临床特征；生存期

含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)是1994年Fernandez-Alnemri等在BenBank表达序列标记数据库中找到一段与ICE/CED-3活性中心同源的序列，并从cDNA文库中克隆而得到的一个基因[1]。该基因编码分子量为32kD的半胱氨酸蛋白酶被命名为Caspase-3[2]。目前研究显示，Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分[3]，Caspase-3在多种肿瘤组织中低表达并与患者的预后不良有关[4-5]。2011年1月—2016年2月，我们采用免疫组织化学SP法检测我院普外科48例结直肠癌组织及癌旁组织中Caspase-3表达水平，探讨其与患者临床特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入标准：年龄大于18周岁；组织病例学证实为结直肠癌；临床病例资料完整，并有完整随访数据；组织病理标本检测经患者或家属书面同意。排除标准：术前接受过新辅助放化疗者；无随访数据；合并其他系统恶性肿瘤。本组共48例，平均年龄（58.66±18.75）岁。男26例，女22例；病理类型乳头状腺癌19例，管状腺癌22例，其他7例。高中分化者21例，低分化者27例。

1.2 仪器与试剂 显微镜（购自日本奥林巴斯公司）、电热恒温箱（上海荣珂检测仪器有限公司生产）、微波炉，台式离心机（购自BechmanCoulter公司）；石蜡切片机（购自德国徕卡公司）。

1.3 主要试剂 鼠抗人Caspase-3单克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司；即用型免疫组织化学法试剂盒，购自上海美轩生物科技公司；DAB显示试剂盒，购自北京中山生物科技有限公司。

1.4 Caspase-3免疫组化检测 组织蜡块连续切片，烤干，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，3%双氧水常温孵育10 min，去除内源性的过氧化氢酶，抗原修复2 min，。滴加Caspase-3单克隆抗体，4℃孵育过夜，滴加生物素化二抗及过氧化物标记的抗体，DAB显色，脱水透明封片。用已知阳性组织切片作阳性对照，用PBS溶液代替一抗作为空白对照，然后显色，最终封片镜检。

1.5 阳性结果判定 采用双盲法对染色结果进行判定，在400倍显微镜下每张载玻片计数5个视野，计数每个视野中细胞总数及Caspase-3阳性的细胞数。阳性细胞均以细胞质中出现棕黄色颗粒为主，极少部分见于细胞核。阳性细胞＜5%为(-)；阳性细胞5%～25%为(+)；阳性细胞25%，50%为(++)；阳性细胞＞50%为(+++)[6]。

1.6 统计分析 采用STATA12.0软件进行统计学处理，计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验或者Fisher确切概率检验；生存分析采用风险比例模型Log-rank检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在癌组织及癌旁组织中的表达 Caspase-3主要表达与胞浆（图1），其在肠癌组织中的阳性表达率为27.08%，癌旁组织阳性率为58.33%，癌组织显著低于癌旁组织(P＜0.05)。

图1 Caspase-3蛋白在癌组织中的表达(A:阴性；B：阳性)

2.2 Caspase-3表达与临床病理特征关系 临床病例特征分析显示，caspase-3阳性表达与患者的肿瘤分期(P＜0.05)和病理分级(P＜0.05)有关。见表1。2.3 Caspase-3表达与预后 Caspase-3阳性患者的中位无疾病进展生存时间为32.4个月，阴性患者为24.8个月。HR=1.67,95%CI:0.68-3.89(P＞0.05)。见图2。

表1 Caspase-3表达与临床病理特征关系

图2 Caspase-3表达阳性与阴性患者生存曲线

3 讨论

结直肠癌是临床上较为常见的一类消化系统肿瘤[7]。来自北美的流行病学研究显示，2012年全美新发结直肠癌患者约14万例，因结直肠癌死亡的人数为5万例[8]。我国缺乏结直肠肿瘤确切的流行病学数据，但各个地方的结直肠癌发病率显示，其发病率位于肺癌、乳腺癌、胃癌之后[9]。结直肠癌的确切病因目前并不完全清楚，大多数研究认为与肿瘤家族史、结肠腺瘤、高脂高蛋白饮食及运动量降低有关[10]。

随着分子生物学的研究进展，结直肠癌的病因及发病机制逐渐明晰。大多数研究认为，结直肠癌是一个涉及多个基因、多步骤的生物学过程[11]。在此过程中存在癌基因的激活、抑癌基因的失活及细胞凋亡的抑制[12-13]。近年来的研究显示，细胞凋亡程序的抑制在结直肠癌发生发展中发挥重要作用[14-15]。而Caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用。曾浩然等[16]探讨了Caspase-3基因在大肠癌、大肠腺瘤中的表达及其与细胞凋亡的关系，显示大肠癌、大肠腺瘤中Caspase-3基因表达与细胞凋亡指数密切相关，阳性表达的细胞平均凋亡指数明显高于阴性表达的平均凋亡指数，而正常黏膜组织中二者无显著性差异。研究认为，肿瘤早期阶段的细胞凋亡异常和过度增生,可能是大肠癌的发病原因之一，作为细胞凋亡的调控因子,Caspase-3可能在大肠癌的发生发展中起重要作用。马颖等[6]采用免疫组织化学法检测了大肠癌中PTEN和Caspase-3的表达情况，发现常黏膜组织Caspase-3的表达高于大肠腺瘤和大肠癌，且Caspase-3阳性表达随肿瘤分化程度的降低而降低。上述研究虽然证实了Caspase-3在肠癌组织与正常肠黏膜中存在差异表达，且与患者临床病理特征存在相关性，但未对Caspase-3表达水平与患者预后的关系进行讨论。

在本研究中，我们发现Caspase-3在癌旁正常肠黏膜中的表达水平显著高于肠癌组织，且Caspase-3表达与患者的肿瘤分期和和病理分级有关。分期晚和病理级别低的组织中Caspase-3阳性频率低，提示Caspase-3表达水平可能与患者的肿瘤病理特征存在相关性。因此，理论上Caspase-3阳性患者预后应好于阴性患者。但关于Caspase-3如何参与肠癌的恶性转化及增殖和侵袭能力等生物学行为仍不十分清楚。

在本研究中，我们采用风险比例模型对比了阴性组与阳性组患者中位无疾病进展生存时间，两者并无统计学差异。分析原因，可能与入组患者例数较少，统计效能较低有关。因此，应加大样本量，延长随访时间，进一步探讨Caspase-3表达水平与结直肠癌患者的预后关系。

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（收稿：2016-12-06 修回：2017-06-02）

（责任编辑 马东旺）

The Clinical Significance of Caspase-3 Expression in Colorectal Cancer

CAO Bin-xiao
Department of General Surgery,Peoples’Hospital of Fenghua City in Zhejiang Province,Fenghua(315500),China

Objective To assess the clinical significance of Caspase-3 expression in colorectal cancer. Methods Forty eight patients with colorectal cancer were included in this study.The Caspase-3 expression was assayed by immunohistochemistry method for the cancer tissue and corresponding para-cancer tissue.The associations between Casepase-3 expression and clinical characteristics,prognosis were evaluated. Results Caspase-3 was mainly expressed in cytoplasm with the positive rate of 27.08%in cancer tissue and 58.33%in normal colorectal tissue.The positive rate in normal colorectal tissue was significant higher than that of cancer tissue with statistical difference(P＜0.05).Caspase-3 expression was associated with the tumor stage(P＜0.05) and pathology grading(P＜0.05).The disease free survival for positive and negative patients were 32.4 and 24.8 months with statistical difference HR=1.67,95%CI:0.68-3.89(P＞0.05). Conclusion The expression rate of Caspase-3 protein in human colorectal cancer tissue is low,which may be related to the occurrence and develop⁃ment of colorectal cancer.

Colorectal cancer;Caspase-3;immunohistochemistry;clinical characteristics;survival

R735.3+7

：A

：1007-6948(2017)04-0353-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.04.004

浙江省奉化市人民医院普外一科（宁波 315500）

曹斌校，E-mail:caobinxiao_fh@126.com