皂荚实生苗与嫁接苗皂刺单株质量及药用成分含量比较

李建军，尚星晨，任美玲，连笑雅，张光田，陈 冰

(1.河南师范大学 生命科学学院/绿色药材生物技术河南省工程实验室，河南 新乡 453007；2.四川秦巴中药科技有限公司，四川 巴中 636600； 3.博爱县武兵皂刺皂角专业合作社，河南 博爱 454450)

皂荚实生苗与嫁接苗皂刺单株质量及药用成分含量比较

李建军1，尚星晨1，任美玲1，连笑雅1，张光田2，陈 冰3

(1.河南师范大学 生命科学学院/绿色药材生物技术河南省工程实验室，河南 新乡 453007；2.四川秦巴中药科技有限公司，四川 巴中 636600； 3.博爱县武兵皂刺皂角专业合作社，河南 博爱 454450)

为了比较皂荚实生苗、皂荚砧木嫁接苗、野皂荚砧木嫁接苗皂刺单株质量及药用成分的差异，采用天平测量3种苗木皂刺单株质量，并分别利用HPLC法和比色法测定其药用成分槲皮素和多酚含量。结果表明，3种苗木皂刺单株质量分别为516、872、335 g，皂荚砧木嫁接苗最高，皂荚实生苗次之，野皂荚砧木嫁接苗最低，相互之间均呈极显著差异；3种皂刺槲皮素含量分别为0.002%、0.001%、0.005%，野皂荚砧木嫁接苗最高，实生苗次之，皂荚砧木嫁接苗最低，相互之间均呈极显著差异；多酚含量分别为0.844%、0.595%、0.859%，野皂荚砧木嫁接苗最高，实生苗次之，二者不存在显著差异，但二者与皂荚砧木嫁接苗相比均呈极显著差异。野皂荚砧木嫁接苗槲皮素和多酚含量均最高但产量最低；皂荚砧木嫁接苗槲皮素和多酚含量均最低但产量最高；皂荚实生苗槲皮素和多酚含量居中，产量亦居中。

皂刺； 实生苗； 嫁接苗； 单株质量； 药用成分

皂荚(GleditsiasinensisLam.)，又名皂角，系豆科苏木亚科皂荚属[1]，是我国分布最广泛的特有树种[2]。皂刺为皂荚的干燥棘刺，又称天丁、皂针等。据药典记载，皂刺有消肿脱毒、破坚削积、排脓、杀虫之功效， 用于痈疽初起或脓成不溃，外治疥癣麻风[3]。皂刺作为传统中草药，在临床上应用十分广泛，常用于治疗阑尾炎、结肠炎、阴道炎等疾病[4]。现代药理学研究表明，皂刺内含有黄酮、酚类、皂苷以及三萜等化合物成分[5]，可作为治疗多种肿瘤的常用配药，例如乳腺癌[6]、宫颈癌[7]、前列腺癌[8]、肺癌[9]、肝癌等[10]，被广誉为十大抗癌中草药之一[11]。

近年来，皂荚资源日趋减少，种质资源丢失严重，皂荚天然林片段化极为严重，大部分地区仅剩下少数散生个体[12]。皂荚荚果、种子、皂刺均可入药，具有极高的经济价值，随着人们对其认识的不断提高，现已有大规模的人工种植。皂荚生长速度慢，需6～8 a才能开花结果[1]，直接限制了皂荚育种工作的推进。嫁接作为植物无性繁殖的重要方法，不仅可以保持亲本优良品种的优良基因，提高皂荚小苗对环境的适应能力，还可以缩短开花结果的年限，甚至可以改良品种达到丰产的效果[13]。目前，国内外用HPLC法测定皂刺药用成分已有文献报道，但嫁接对皂刺单株质量及药用成分的影响研究尚未见报道。本试验以皂荚实生苗以及皂荚和野皂荚为砧木的2种嫁接苗为样品，比较3种苗木皂刺的单株质量，并分别采用HPLC法和比色法测定3种皂刺的槲皮素和多酚含量，旨在探讨嫁接对皂刺产量及药用成分含量的影响，为皂荚资源评价和新品种选育提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

仪器：FA2204B电子分析天平、Agilent高效液相色谱仪、KH-250D型超声波清洗器、DHY-300超微粉碎机、索式提取器、ZRD-A5110电热恒温鼓风干燥箱。

试剂：超纯水，乙腈、甲醇(色谱纯，天津市科密欧试剂有限公司)，磷酸(分析纯，天津市北辰方正试剂厂)，碳酸钠(天津市北辰方正试剂厂)，槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所)，没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所)。

Folin-Ciocalteu 试剂(简称 FC 试剂)：于 1 000 mL磨口回流装置内加入钨酸钠 50 g、钼酸钠 12.5 g、蒸馏水 350 mL、浓磷酸(14 mol/L)25 mL、浓盐酸(12 mol/L)50 mL，充分混匀，微沸回流 10 h，称取Li2SO4·H2O 87.29 g，少量多次加入到圆底烧瓶内，滴加溴水数滴，开口沸腾，使溴水完全挥发为止，冷却，定容至500 mL，过滤，置于棕色瓶中保存备用，使用时用1倍蒸馏水稀释[3]。

1.2 供试材料

供试材料皂刺采自河南省博爱县。实生苗树龄4 a；嫁接苗树龄：砧木2 a，嫁接4 a。皂荚砧木嫁接苗、野皂荚砧木嫁接苗接穗均为实生苗接穗。采集时间为2016年10月26日，把相同编号的样品均匀混在一起，烘干，粉碎，过孔径0.3 mm的筛。

1.3 测定指标和方法

1.3.1 皂刺单株质量的测定 每一类苗木随机选取30株皂荚树，用电子天平测定其皂刺单株质量。

1.3.2 槲皮素含量的测定(HPLC法)

1.3.2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ODS C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(体积比为30∶70)，流速为1 mL/min，检测波长为360 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL[14]。

1.3.2.2 槲皮素对照品溶液的制备 精密称取10 mg槲皮素对照品，加甲醇定容至25 mL容量瓶，得到0.4 g/L的对照品母液，再分别配制0.003 2、0.006 4、0.009 6、0.012 8、0.001 6、0.019 2 g/L的对照品溶液。

1.3.2.3 槲皮素对照品线性关系的考察 取各个质量浓度对照品溶液分别进样10 μL，按照1.3.2.1色谱条件进行分析，以槲皮素的质量浓度(g/L)为横坐标(x)、峰面积(mAU)为纵坐标(y)，绘制标准曲线。

1.3.2.4 皂刺槲皮素样品溶液的制备 精密称取5 g皂刺粉末，置于索式提取器中，加入40 mL甲醇，浸泡过夜，再加入100 mL甲醇，加热至沸，提取4 h，放冷，过滤，蒸干滤液，加甲醇定容于25 mL容量瓶中，经 0.45 μm有机微孔滤膜滤过后测定。

1.3.3 多酚含量的测定(比色法)

1.3.3.1 没食子酸对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品18 mg，用蒸馏水溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，得质量浓度为0.18 g/L的对照品标准溶液。

1.3.3.2 供试品溶液的制备 精密称取5 g皂刺粉，置250 mL棕色容量瓶中，加水150 mL，放置过夜，超声处理15 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，弃去初滤液50 mL。精密量取续滤液20 mL，置100 mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得[3]。

1.3.3.3 标准曲线的绘制 准确吸取没食子酸对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，将其放入25 mL的棕色容量瓶中,各加入FC试剂1 mL，再分别加入11.9、11.8、11.6、11.4、11.2、11.0 mL水，用29%碳酸钠溶液稀释到刻度，摇匀，放置30 min，以相应试剂为空白对照，测定A760值，以没食子酸的质量浓度(g/L)为横坐标(x)、A760值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。

1.3.3.4 样品含量的测定 吸取供试品溶液2.0 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加入FC 试剂1 mL，再加入10 mL水，用29%碳酸钠溶液稀释到刻度，摇匀，在上述相同的显色条件下测定其A760值，计算其质量浓度。

2 结果与分析

2.1 槲皮素、没食子酸2种对照品标准曲线的绘制

槲皮素标准曲线见图1，其回归方程为y=31 003x-4.370，R2=0.998，表明槲皮素质量浓度在0.003 2～0.019 2 g/L时与峰面积呈良好线性关系。没食子酸标准曲线见图2，其回归方程为y=103.9x+0.046，R2=0.998，表明没食子酸质量浓度在0.000 72～0.007 20 g/L时与吸光度呈良好线性关系。

2.2 3种不同类型皂荚苗木皂刺单株质量比较

3种皂荚皂刺单株质量的差异见图3。由图3可知，皂荚砧木嫁接苗皂刺单株质量最高，为872 g，实生苗次之，为516 g，野皂荚砧木嫁接苗皂刺单株质量最低，为335 g，3种皂荚苗木皂刺单株质量间均差异极显著。野皂荚砧木嫁接苗生长在太行山上，环境恶劣，水肥不足，生长缓慢，产量较低；实生苗和皂荚砧木嫁接苗生长在农户家，由农户悉心照顾，水肥充足，生长速度快，产量相对较高。

图1 槲皮素标准曲线

图2 没食子酸标准曲线

不同大、小写字母分别表示在0.01、0.05水平差异显著，下同

2.3 3种不同类型皂荚苗木皂刺2种药用成分含量比较

由表1可知，野皂荚砧木嫁接苗槲皮素含量最高，实生苗次之，皂荚砧木嫁接苗含量最低，3种皂荚嫁接苗皂刺中槲皮素含量均呈现极显著差异；多酚含量以野皂荚砧木嫁接苗最高，实生苗次之，皂荚砧木嫁接苗最低，实生苗与野皂荚砧木嫁接苗差异不显著，但二者与皂荚砧木嫁接苗之间差异极显著。野皂荚砧木嫁接苗生长在太行山上，环境恶劣，水肥不足，生长缓慢，药用成分积累较多；实生苗和皂荚砧木嫁接苗生长在农户家，由农户悉心照顾，水肥充足，生长速度较快，药用成分积累较少。

表1 皂荚实生苗与嫁接苗皂刺药用成分含量比较

3 结论与讨论

参阅大量文献发现[15-17]，我国对皂荚的研究主要集中在其药用部位的生药学鉴定、药理学及临床应用，关于其有效成分的分离、含量测定方法及指纹图谱建立的研究相对较少，也有部分关于皂荚嫁接技术研究的文献报道，但针对嫁接对皂刺产量及药用成分的影响方面的研究尚未见报道。

通过对3种皂荚苗木皂刺单株质量的比较分析发现，皂荚砧木嫁接苗皂刺单株质量最高，实生苗次之，野皂荚砧木嫁接苗最低，3种皂荚苗木皂刺单株质量彼此间均呈现极显著差异。皂刺的产量可以作为皂荚资源评价的依据之一。

刘艳明等[15]采用HPLC法对皂刺的各类成分进行研究，得出皂刺含有黄酮、多酚、三萜皂苷、香豆素、甾醇、内脂、三萜等成分。黄酮类中的槲皮素和黄颜木素是皂刺抗肿瘤的重要活性成分[16]，我国药典未规定其含量的测定方法。多酚具有清除机体内自由基、抗脂质氧化、延缓机体衰老、防癌、抗辐射等功效，我国药典以没食子酸为对照品采用比色法测定其含量。本课题组选取皂刺中槲皮素和多酚2种有效成分，分别采用HPLC法和比色法对3种苗木进行测定。结果表明，野皂荚砧木嫁接苗槲皮素和多酚含量最高，实生苗次之，皂荚砧木嫁接苗槲皮素和多酚含量均最低。三者槲皮素含量均呈极显著差异；实生苗与野皂荚砧木嫁接苗多酚含量差异不显著，二者与皂荚砧木嫁接苗差异极显著。

野皂荚砧木嫁接苗生长在太行山上，环境恶劣，水肥不足，导致其生长缓慢，药用成分积累较多，但产量较低；实生苗和皂荚砧木嫁接苗生长在农户家，由农户悉心照顾，水肥充足，生长速度较快，药用成分积累较少，但产量相对较高；嫁接不仅很好地保持了亲本的特性，提高了皂荚小苗对环境的适应能力，也缩短了皂荚开花结果的年限，但相同环境条件下皂荚砧木嫁接苗次生代谢产物槲皮素和多酚低于实生苗，深层次的生理机制有待进一步研究。综上所述，野皂荚砧木嫁接苗槲皮素和多酚含量较高，为野生皂荚残次林通过嫁接改造成药用经济林提供了理论支撑，实生苗药用成分槲皮素和多酚含量高于同环境条件下嫁接苗，为嫁接繁育和生产及资源评价提供了理论依据。

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Comparative Research on Individual Plant Quality and Medicinal Ingredients Content of the Spines ofGleditsiasinensisLam.Stock Seedlings and Grafted Seedlings

LI Jianjun1,SHANG Xingchen1,REN Meiling1,LIAN Xiaoya1,ZHANG Guangtian2,CHEN Bing3

(1.College of Life Science,Henan Normal University/Henan Engineering Laboratory of Green Medicine Biotechnology,Xinxiang 453007,China; 2.Sichuan Qinba Traditional Chinese Medicine Technology Co.,Ltd.,Bazhong 636600,China; 3.Boai County Wubing Gleditsia Sinensis Cooperatives,Boai 454450，China)

In order to compare the individual plant quality and medicinal ingredients content of the spines,the spine mass ofGleditsiasinensisLam.stock seedlings,grafted seedlings onGleditsiasinensisLam.andGleditsiamicrophyllawere measured by balance,and polyphenols and quercetin contents were calibrated through HPLC and colorimetric method.The results showed that the individual plant qualities of the three kinds ofGleditsiasinensisLam.spines were 516 g,872 g and 335 g,grafted seedlings onGleditsiasinensisLam.were the highest among them,the second were stock seedlings,grafted seedlings onGleditsiamicrophyllawere the lowest,and they had significant difference respectively.The quercetin contents of the three kinds ofGleditsiasinensisLam.spines were 0.002%,0.001%,0.005%,grafted seedlings onGleditsiamicrophyllawere the highest,the second were stock seedlings,grafted seedlings onGleditsiasinensisLam.were the lowest,and they had significant difference respectively.The total polyphenol contents were 0.844%,0.595%,0.859%,grafted seedlings onGleditsiamicrophyllawere the highest,the second were stock seedlings,there was no significant difference between them,but the two had extremely significant difference compared with grafted seedlings onGleditsiasinensisLam.In conclusion,quercetin and total polyphenol contents of grafted seedlings onGleditsiamicrophyllawere highest but the production was lowest,the second were stock seedlings and so was its production,grafted seedlings onGleditsiasinensisLam.were lowest but had the highest production.

the spines ofGleditsiasinensisLam.; stock seedlings; grafted seedlings; individual plant quality; medicinal ingredients

2017-02-22

中医药公共卫生专项 (财社 [2011]76 号)；中医药行业科研专项(201207002);河南省教育厅重点研究应用项目 (15A180043)；横向项目：联合开发药用资源皂荚

李建军(1964-)，男，河南延津人，副教授，硕士，主要从事药用植物育种与资源开发方面的研究。 E-mail:043081@htu.cn

S792.99

A

1004-3268(2017)08-0107-04