大约克种猪抗腹泻新品系导入新血缘

2017-09-01龙清孟熊胜利代兴洪冯文武王锦凤申金蓉冉雪琴贵州省种畜禽种质测定中心贵州贵阳55008贵州大学贵州贵阳55005

养猪 2017年4期

龙清孟，熊胜利，代兴洪，冯文武，侯萍，金敏，王锦凤，龚菲，申金蓉，冉雪琴（.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州贵阳 55008；.贵州大学，贵州贵阳 55005）

大约克种猪抗腹泻新品系导入新血缘

龙清孟1，熊胜利1，代兴洪1，冯文武1，侯萍1，金敏1，王锦凤1，龚菲1，申金蓉1，冉雪琴2（1.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州贵阳 550018；2.贵州大学，贵州贵阳 550025）

引起断奶前后仔猪腹泻的主要致病菌是猪肠毒素性大肠杆菌（ETEC），而F4ac型是ETEC中流行性最为广泛的类型。试验在贵州省种畜禽测定中心种猪场内进行，试验猪群为已经选育出的美系大约克抗腹泻专门化新品系，试验目的是对已经培育出的美系大约克抗腹泻专门化新品系，导入加系大约克血缘，避免新品系在闭锁选育中出现近亲衰退。2016年7月引种，9月9日对引进的22头加系大约克种猪采样，送往贵州大学动物科学院对猪肠毒素性大肠杆菌（ETEC）F4ac的受体基因MUC13进行基因型鉴别。结果显示，GG基因型频率为13.64%（3/22）、GA基因型频率68.18%（15/22）、AA基因型频率18.18%（4/22），G基因频率0.477 3、A基因频率0.522 7。在保留引进加系大约克血统需要的前提下，将腹泻抗性基因GG型个体直接选入美系大约克抗腹泻新品系群体，同时，尽可能保留繁殖性能较为优秀的GA、AA基因型个体，与原有的美系抗腹泻种猪按照不同选配组合方案进行配种：GA♂×GG♀、GG♂×GA♀、GG♂×AA♀、AA♂×GG♀，在世代选育中逐渐加大后代腹泻抗性有利基因型GG个体选留力度，将腹泻抗性有利基因GG型个体选入抗腹泻新品系中，最终实现腹泻抗性有利基因血缘更新，并纯繁推广。

引进加系；大约克种猪；抗腹泻基因；腹泻抗性新品系；导入新血缘

肠毒素性大肠杆菌（ETEC）F4ac是引发新生仔猪和断奶前仔猪腹泻的最主要致病菌[1-2]。F4ac型是肠毒素性大肠杆菌ETEC（F4）菌毛3种血清型（F4ab型、F4ac型、F4ad型）中致病性最强、流行性最广的一类[3-4]。在世界范围内，肠毒素性大肠杆菌（ETEC）感染导致的仔猪腹泻每年都给养猪业造成很大的经济损失[5-6]。在养猪业发达的瑞典、英国和丹麦，新生仔猪腹泻的发生率分别为75.0%、50.5%和36.6%[7-8]。我国仔猪腹泻的发生率也很高，2012年对国内某省4 118个养猪场户进行的流行病学调查发现，哺乳仔猪腹泻发生率高达18.31%、死亡率在10.44%～57.01%之间[9-10]。早年在猪流行性腹泻病毒还没被大量报道之前，我国仔猪腹泻的发生率全年平均高达46.5%[11]，个别地区甚至更高。近年来更是出现猪流行性腹泻病毒和ETEC混合感染导致仔猪大面积发生腹泻和死亡的事件。因此，进行肠毒性大肠杆菌（ETEC）F4ac腹泻基因的选育，培育抗腹泻新品系，可以从种源上最大限度控制新生仔猪及断奶前仔猪的腹泻发生率，从而提高猪场的经济效益和国外引进种猪的使用价值。

本中心猪场曾对引进美国大约克种猪基础猪群采耳样组织，送往江西农业大学进行抗腹泻基因检测研究，结果显示，大约克种猪在MUC13基因的腹泻抗性等位基因GG型的频率为16.79%（23/137），G基因频率为0.46，腹泻易感不利等位基因（A）基因频率为0.54[12-13]。这一检测结果表明，利用分子育种技术辅助育种，兼顾选留表型和生产性能优秀个体，逐世代加大GG纯合抗性个体的选留比例，逐步淘汰AA和AG易感基因型个体，可使育种猪群中有利基因频率提高，最终建立抗K88（F4ac）腹泻专门化品系。近年来，测定中心的技术人员，致力于研究国外引进种猪抗性新品系的培育工作及推广应用。种猪场在世代选育中采用抗腹泻基因检测技术，保留腹泻抗性有利基因GG型个体，组建核心群种猪抗腹泻新品系，建立大约克种猪抗腹泻选育示范点。测定中心技术人员开展了大约克种猪6个不同基因型的组合配种方案：GG♂×GG♀、GA♀×GG♂、GA♂×GA♀、AA♂×GG♀、AA♂×GA♀、AA♂×AA♀，在相同的饲养环境条件下，跟踪观察其哺乳仔猪腹泻发生率、腹泻致死率、其他原因致死率、断奶成活率，结果表明，不同组合选配所生仔猪在哺乳期间的腹泻发生率相应为2.71%、26.44%、46.18%、30.32%、40.96%、44.14%，其后代腹泻致死率相应为0、3.07%、6.49%、3.94%、11.65%、12.5%，其哺乳仔猪其他原因致死率相应为0.78%、1.92%、2.67%、1.97%、4.42%、5.08%，其断奶成活率相应为 99.22%、95.02%、90.84%、94.09%、83.94%、82.42%[12]。研究表明，组合选配优秀情况依次为GG♂×GG♀>GA♀× GG♂>AA♂×GG♀>GA♂×GA♀>AA♂×GA♀>AA♂×AA♀。在初步建立大约克抗腹泻新品系的基础上，2016年7月引进加系大约克种猪22头，导入新血缘。引进种猪抗腹泻基因检测及不同基因型个体选配计划如下。

1 材料与方法

1.1 样品

贵州省种畜禽种质测定中心2016年7月新引进的5月龄加系大约克种猪22头，在隔离观察期满、健康检查各项指标合格后，9月9日采用前腔静脉采血（22份），送贵州大学动物科学院冉雪琴教授的实验室进行抗腹泻基因的检测研究。每份血样10 mL（全血），于离心管中-20℃保存，采用天根生化科技（北京）有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒制备基因组DNA，作为PCR检测的模板。

1.2 主要试验仪器设备

①离心机（Avanti-J30I），美国贝克曼库尔特公司生产；②制冰机（banshen），美国Grant公司生产；③凝胶成像系统（GelDocXR），美国Bio-rad公司生产；④荧光定量PCR仪（MyCycler），美国Bio-rad公司生产；⑤标准型净化工作台（SW-CJ-IFD），上海锦星科学仪器有限公司生产；⑥电泳仪（DYY．III2稳压电泳仪），北京六一仪器厂生产；⑦-80℃超低温冰箱，美国Thermo公司生产；⑧水浴恒温锅（SHZ-82），中国金坛市医疗仪器厂生产。

1.3 PCR扩增

根据GenBank上公布的猪MUC13基因序列设计4条特异性引物（表1），由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

表1 引物序列

PCR反应体系为10 μL：2×PCR mix 5.0 μL，引物（10 pmol/L）各0.5 μL，基因组DNA（100 ng/μL）1.0 μL，双蒸水补足10 μL体积。扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃/63℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 试验结果

2.1 基因型检测结果

将电泳得到的83 bp条带定为G基因，173 bp条带定为A基因；那么只有1条173 bp条带的样品则定义为AA基因型个体，只有1条83 bp条带的样品则定义为GG基因型个体，而既有173 bp条带、又有83 bp条带的样品则为杂合的AG基因型。图1为AA基因型和GG基因型检测结果。

图1 引进加系大约克种猪抗腹泻有利基因GG型及易感基因AA型

2.2 克隆测序

将得到的173 bp和83 bp两种条带分别切胶回收，连接T-载体，送基因公司克隆测序。根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，证实扩增片段确为MUC13基因，位于内含子7当中，并证实相应位置的碱基确为G或A。

2.3 引进加系大约克种猪抗腹泻基因检测结果

由表2可知，GG型个体3头（1公2母），GA型个体15头（全部为母猪），AA型个体4头（1公3母）。

表2 22头新引进的5月龄加系大约克种猪抗腹泻基因检测结果及选配计划

2.4 MUC13基因的基因型频率和基因频率

由表3可知，新引进的5月龄加系大约克GG基因型13.64%（3/22）、GA基因型频率68.18%（15/ 22）、AA基因型频率18.18%（4/22），G基因频率47.73%、A基因频率52.27%。

表3 新引进22头加系大约克猪MUC13基因的基因型频率和基因频率

3 分析与讨论

3.1 抗性新品系建立后导入新的血缘

在纯种繁育场已建立健全血统、系谱完整的抗性新品系，并且在抗腹泻新品系稳定的情况下，通过引种导入新血缘，避免重蹈闭锁选育的覆辙。

（1）首先，通过对引进加系大约克种猪的检测，明确猪肠毒素性大肠杆菌（ETEC）F4ac的受体基因MUC13的基因型。

本次研究结果显示，引进加系大约克种猪在MUC13基因GG基因型频率13.64%（3/22）、GA基因型频率68.18%（15/22）、AA基因型频率18.18%（4/22），G基因频率0.477 3、A基因频率0.522 7，这一检测结果与美系大约克种猪GG基因型频率为16.79%（23/137）、GA基因型频率59.12%（81/137）、AA基因型频率24.10%（33/137），G基因频率为0.46、A基因频率为0.54[12-13]的结果基本一致。

（2）其次，在明确猪群受体MUC13基因型的基础上，优先考虑选配方案为GG♂×GG♀。

在考虑引进种猪的血统、繁殖性能、表型等指标的前提，将新引进加系大约克与原有美系大约克或新引进加系之间，按照GG♂×GG♀选配，加大世代抗腹泻基因GG型个体选育力度，每年根据血统需要选留体型外貌、生产性能等优秀的个体作为后备种猪，进入腹泻抗性新品系群体。

（3）再次，将新引进加系大约克与原有美系大约克、或加系与加系猪、美系与美系之间依次考虑GA♂×GG♀、GG♂×GA♀、GG♀×AA♂、GA♂×AA♀、GA♂×GA♀等配种方案。

依据前人的研究结果和我们的检测分析，对后备种猪和基础种猪进行选择时，选育时首先把生产性能、体型外貌都表现优秀的GG基因型个体作为种公猪和种母猪进行扩繁。本研究根据生产需要，尽可能保全猪场血统，对繁殖性能、体型外貌优秀的GA型、AA型个体，可考虑采用GA♂×GG♀、GG♂×GA♀、AA♂×GG♀、GG♂×AA♀、GA♂×GA♀等配种方案，最终选留到抗腹泻基因GG型优秀个体，再逐步淘汰基因GA型、AA型个体。

3.2 大约克种猪腹泻抗性新品系的选育需要足够长的时间

测定中心对自己猪场繁殖群的研究表明，猪肠毒素性大肠杆菌（ETEC）F4ac的受体基因MUC13抗腹泻有利基因GG基因型频率和G基因频率大约克繁殖群分别为16.79%（23/137）、0.47；在杜洛克繁殖群分别高达86.05%（37/43）、0.92；而在长白猪繁殖群中分别为40.74%（11/27）、0.47[13]。这一结果说明，在抗腹泻有利基因GG基因型频率和G基因频率上，大约克猪群<长白猪群<杜洛克猪群，在世代选育中，大约克比长白猪群、杜洛克猪群较难选育出纯合腹泻抗性GG型个体，完全建立抗腹泻新品系的时间相对较长。

纯种大约克抗腹泻新品系在世代选育中，需要考虑保全种猪血统、兼顾生产性能及表型等指标。因此，在兼顾种猪血统、生产性能、体型外貌选育基础上，不仅需要保留抗腹泻有利基因GG型个体，同时有必要将生产性能、体型外貌都表现优秀的腹泻易感基因型GA、AA型个体先保留下，按照GG♂×GA♀、GA♂×GG♀、GG♂×AA♀、AA♂×GG♀、GA♂×GA♀等选配组合，最终选育出该血统抗腹泻GG型后代作为后备种猪，再逐步淘汰腹泻易感基因型GA型父本、母本，建立血统较为完善的新品系。对以上5个组合选配的后代，如果采用整窝仔猪都作抗腹泻基因检测，那么，检出GG型的个体长大后也不一定能作为后备猪，这一方法增加了新品系选育的成本；如果是按照常规选育选留后备猪，再对选留后备猪采样作抗腹泻基因检测，所选留的猪不一定都检出抗腹泻基因GG型个体，可能只有一定比例的后备猪检出抗腹泻GG型，所以采用这种选育方案就需要选留足够数量的后备猪，因为不一定在F1代中检出GG型个体，可能在F2代甚至F3代中才能选留到抗腹泻基因型GG个体作为后代。因此，大约克多个血统抗腹泻新品系的选育，需要相对足够长的时间（3～6年），才能圆满完成选育研究任务。

3.3 杂交利用

抗性新品系进行杂交利用，其后代的腹泻抗性情况有待于进一步深入研究。

[1]唐建红，邓政，林峰，等.抗仔猪断奶前腹泻猪专门化新品系的培育[J].猪业科学，2013（10）：102-105.

[2]Kolotilin I,Kaldis A,Devriendt B,et al．Production of a subunit vaccine candidate against porcine post-weaning diarrhea inhigh-biomass transplastomic tobacco[J].PLoS One,2012,7(8): e42405.

[3]Joller D,Jorgensen C B,Bertschinger H U,et al.Vogeli P Refined localization of the Escherichia coli F4ab/F4ac receptor locus on pig chromosome 13[J].Animal Genetics,2009,40(5): 749-752.

[4]Ren J,Yah X,Ai H,et al.Susceptibility towards enterotoxigenic Escherichia coli F4ac diarrhea is governed by the MUC13 gene in pigs[J].PLoS One,2012,7(9):e44573.

[5]Zhang Francis D H.Genetic fusions of heat-labile toxoid(LT) and Heat-stable toxin b(STb)of porcine enterotoxigenic Escherichiacolielicitprotectiveanti-LTandanti-STbantibodies[J]. Clinical and Vaccine Immunology,2010,l7(8):1223-1231.

[6]Zanello G Berri M,Dupont J,et al.Saccharomyces cerevisiae modulates immune gene expressions and inhibits ETEC mediated ERK1/2 and p38 signaling pathwaysinintestinal epithelial ceils[J].PLoSOne,2011,6(4):e18573.

[7]Pearce G P.Epidemiology of entericdisease in grower-finisherpigs:apostal surveyof pig producers inEngland[J].The Veterinary record,1999,144:338-342.

[8]Johansen M,Alban L,Kjærsgaard H D,et al.Factors Influencing the Weight Gain of Piglets[C]//Proceedings of the 17th International Pig Veterinary Society Congress.(Iowa,U.S.A), 2002,1:227.

[9]赵明军，闰若潜，盛敏，等.仔猪腹泻病流行形势与防控措施[J].养猪，2013（2）：109-110.

[10]龙清孟，熊胜利，龚菲，等.从规模化猪场仔猪死亡数据分析研究提高仔猪成活率对策[J].猪业科学，2014（8）：113-116.

[11]王红宁.仔猪腹泻成因及综合防治技术措施[J].中国畜牧杂志，2006，42（6）：58-60.

[12]熊胜利，龙清孟，陈大芳，等.对引进美国SPF大约克种猪抗腹泻后代选育探讨[J].养猪，2013（5）：49-50.

[13]熊胜利，龙清孟，陈大芳，等.抗病育种技术在引进美国SPF种猪后代选育中应用探究[J].养猪，2014（3）：73-74.

（感谢贵州大学动物科学学院冉雪琴教授对项目研究的大力帮助！）

（编辑：富春妮）

白面包和全麦面包哪个更好

【美国《发现》月刊网站6月6日文章】题：面包之争：工业白面包还是手工全麦面包？（作者卡尔·恩格尔金）

做三明治时更加健康的选择是哪个：工业加工的白面包，还是手工制作的全麦面包？

对于想知道这种热烈争论的问题明确而且非黑即白答案的人，我们要先表示歉意。答案是两个都好，因人而异。

这个结论来自以色列的魏茨曼科学研究所，该研究所近期对比了吃白面包或全麦面包以获得大量卡路里的饮食方式的短期健康影响。在随机化的试验中，科学家要求20名健康的人增加一周的面包摄入量—从每天占卡路里摄入量的10%提升到占25%。一半的参与者食用工业的白面包补充面包摄入量，而另一半吃当地面包店准备的全麦面包。

第一周结束后，所有参与者在所谓的清除阶段的两周内完全不吃面包。然后再重复试验，但这次是第一周吃白面包的人改吃全麦面包，吃全麦面包的人改吃白面包。

在每一个试验阶段之前、之中和之后，研究人员检测了参与者的一系列健康指标：清晨血糖水平、炎症和组织损伤的标记、胆固醇水平、肾和肝的各种酶以及维生素和矿物质水平。研究人员还采集了每个人的粪便样本，以评估每个人的微生物情况，也就是每个人肚子里的细菌。

简而言之，每个人的结果都不同。一些人在转变为吃白面包以后新陈代谢反应变得更好，而其他人在吃全麦面包的时候表现更好。研究人员把整组数据放在一起平均以后，结果没有什么用—白面包和全麦面包之间不存在临床上具有显著意义的区别。6日研究人员把该成果发表在《细胞-代谢》月刊上。

但是有个重要的解释：所有参与者都摄入了同样量的碳水化合物，而全麦面包所含的碳水化合物较少，因此表明参与者吃的全麦面包多于白面包。

该研究的作者之一亚伯拉罕·利维说：“我们没有考虑到你会吃多少是建立在你感觉多饱的基础上，所以还需要进一步研究。”

研究人员表示，他们的研究鼓励大家不要听信一些不合理的理论，也不要跟从统一的饮食建议，而是更应该关注每个人的不同之处。2015年，魏茨曼科学研究所的同一个团队要求800个人吃完全相同的东西，每个人代谢食物方式都不同。换句话说，对一个人来说健康的饮食可能对另一个人来说就不健康。

该研究的作者之一埃兰·埃利纳夫说：“迄今为止，食物的营养价值都是基于最基本的科学计算出来的，不存在适合所有人的单一饮食方式。”

（转自参考消息[N]，2017-06-17）

S828.8

1002-1957(2017)04-0053-04

2017-06-06收稿，2017-07-03修回

贵州省农业攻关课题[黔科合NY字（2012）3061号]；贵州省农委2009年立项—引进美国良种猪场口蹄疫、猪瘟等重大传染性疾病防控技术研究