糖肾平含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及RhoA/ROCK信号通路影响的研究＊

苗永辉，赵宗江，杨冠男，王婷，黄雅薇，张紫嫣

糖肾平含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及RhoA/ROCK信号通路影响的研究＊

苗永辉，赵宗江＊＊，杨冠男，王婷，黄雅薇，张紫嫣

（北京中医药大学中医学院北京100029）

目的：探讨糖肾平含药血清对高糖刺激肾小管上皮细胞增殖作用及RhoA/ROCK信号通路的影响。方法：制备鼠含药血清；培养肾小管上皮细胞分为：正常组，高糖组，抑制剂（Y27632）组，厄贝沙坦组，糖肾平低、中、高剂量组，3000细胞/孔种于96孔板，每组8个复孔，12、24、48、60 h观察细胞，MTT法检测细胞增殖。Western blotting检测肾小管上皮细胞中RhoA、ROCK1、α-SMA和E-Cadherin蛋白的表达。结果：高糖诱导后细胞呈梭型或不规则三角形；含药血清干预后，细胞呈扁平不规则多角形。MTT：12 h，与正常组比，各组OD值升高；24、48、60 h，与正常组比，高糖组OD值显著升高（P＜0.01）；与高糖组比，各治疗组OD值有不同程度降低（P＜0.05），48 h，与Y27632组、厄贝沙坦组和糖肾平高剂量组比，糖肾平低、中剂量组OD值降低（P＜0.05）；60 h，与Y27632组比，糖肾平中剂量组降低；与厄贝沙坦组比，糖肾平各剂量组OD值降低（P＜0.05）；与糖肾平高剂量组比，糖肾平低剂量组升高（P＜0.05）。Western blotting，与正常组比，高糖组E-Cadherin蛋白表达减少，RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白表达增加（P＜0.01）；与高糖组比，各组E-Cadherin蛋白表达增加，RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白表达减少，高剂量组有显著差异（P＜0.01）；与Y27632组比，糖肾平高剂量组ROCK1、E-Cadherin和α-SMA蛋白表达无统计学差异（P＞0.05），RhoA蛋白表达减少（P＜0.01）；与厄贝沙坦组比，糖肾平高剂量组RhoA、ROCK1、E-Cadherin和α-SMA蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）。结论：糖肾平通过抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖和RhoA/ROCK信号通路相关分子的表达，从而逆转上皮-间质转分化，抑制肾间质纤维化，延缓糖尿病肾病病情进展。

糖肾平肾痿肾小管上皮细胞株KKAy小鼠细胞增殖MTT EMTRhoA/ROCK信号通路

随着社会经济发展、饮食结构以及生活方式的改变，糖尿病（Diabetic Mellitus，DM）发病率不断攀升，中国在过去30年，DM发病率急速上升，约0.92亿成年人罹患DM，20%～30%发展为糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease，DKD），并最终成为终末期肾病（End Stage Renal Disease，ESRD）的主要原因[1]。目前对DKD的治疗，西医主要釆取血管紧张素转化酶抑制剂（Angiotension Converting Enzyme Inhibitors，ACEI）和血管紧张素受体阻滞剂（Angiotensin Receptor Blocker，ARB）联合治疗来降低蛋白尿，但其安全性和对肾脏病进展的影响尚不清楚，中医药治疗DKD有独特的优势，在临床广为应用[2]，我们课题组前期的研究选取SD大鼠、Wistar大鼠和KKAy小鼠3个品种的实验动物以及大鼠肾小球足细胞和小鼠肾小管上皮细胞2个品种的实验细胞，研究涉及从下调糖尿病肾病肾组织中单核细胞趋化因子-1（Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），减少细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）在肾小球系膜区以及肾小管间质的沉积、修复足细胞损伤、抑制足细胞凋亡、逆转足细胞转分化和抑制肾小管上皮细胞转分化等五大方向，研究结果表明，无论是整体动物实验中还是体外细胞实验中，在“肾痿”科学假说指导下组方的糖肾平均展示出了良好的肾脏保护作用和DKD治疗效果[3]。DKD时，肾小管上皮细胞受损，损伤后的细胞增殖能力增强，有两种发展方向，一是通过细胞增殖，产生与损伤前细胞类型一样的细胞，补充功能缺陷的细胞；二是细胞增殖后发生转分化，形成其他类型的细胞，如成纤维细胞，该转分化后的细胞迁移到肾间质分泌大量细胞外基质，加速DKD的病理进程[4]，因此我们推测，通过抑制细胞增殖实验，可以间接说明肾小管上皮细胞转分化的科学问题。肾小管上皮细胞转分化是DM引起肾损害的重要病理机制，有研究表明高糖能激活RhoA/ROCK信号转导通路上的关键分子Ras同源基因家族成员A（RasHomolog Gene Family Member A，RhoA）和Rho相关卷曲蛋白激酶（Rho-Associatedcoiled-Coil-Containing Protein Kinase 1，ROCK1），介导肾小管上皮细胞-间质转分化（Epithelial-to-Mesenchymal Transition，EMT）的发生[5]，本研究探讨糖肾平含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及RhoA/ROCK信号通路的影响，为“肾痿”科学假说提供新的实验依据。

1 实验材料

1.1 主要仪器与试剂

倒置显微镜（日本Olympus公司)，超净工作台（北京市昌平长城空气净化设备公司），恒温CO2培养箱（编号：B5060EK/CO2，德国产），0.22µm滤器（Millipore，R6MA90693），离心机（Germany，MIKR220R），25 cm2培养瓶（Corning，4306301），450型自动酶标仪（MuLtiskanAseentvl.24345-00627T）（美国百特公司）；BIO-RAD成像系统（美国Bio-Rad公司）。

RPMI1640培养基（Roswell Park Memorial Institute 1640）（Gibco，货号/批号：31800-022/1786043）、胰蛋白酶1:250（Amresco，货号/批号：0458-25G/1554C333）；胎牛血清（HyClone，货号/批号：SV30087.01/ NZE1145）；碳酸氢钠（北京化学试剂公司，产品批号：030918）；MTT（4-甲基偶氮唑蓝，Amresco，货号/批号：0793/20120308418）；DMSO（Amresco，货号/批号：0231-500ML/2075C127）；EDTA·2Na（北京鼎国生物技术发展中心生产，产品批号：C087），青链霉素混合液（Solarbio，货号：P1400），右旋葡萄糖（D-GLU, Amresco，货号/批号：0188-500G/1056C459），通用型蛋白酶抑制剂（MERCK，539134）；蛋白抽提试剂（MERCK，71009-3CN）；BCA法蛋白定量试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司，货号/批号：P1511/ 20151511052003）；一抗β-actin（美国Cell Signaling Technology公司，货号/批号：4970/0011）；RhoA（美国Novus Biologicals公司，货号/批号：NB100-91273/ Rb0322-200308-WS）；ROCK1（英国Abcam公司，货号/批号：ab134181/GR149410-2）；α-SMA（英国Abcam公司，货号/批号：ab32575/GR32377-41）；E-Cadherin（英国Abcam公司，货号/批号：ab76055/GR216035-1）；二抗山羊抗兔（英国Abcam公司，货号/批号：ab6721/ GR231489-1）；山羊抗鼠（英国Abcam公司，货号/批号：ab6789/GR215715-5）；ECL超敏发光液（德国MerckMillipore公司，货号/批号：WBKLS0100/1316802）。

1.2 实验药物与细胞

糖肾平（生黄芪6 g、熟地黄3 g、山萸肉2 g、翻白草3 g、白花蛇舌草3 g、水蛭2 g，北京中医药大学中药学院制剂室制备，批号：2016008，具体制备工艺见参考文献[4]）；厄贝沙坦片（赛诺菲安博维，国药准字J20130 049）；Y27632（美国Sigma，批号：046M4746V）。C57BL/ 6小鼠近端肾小管上皮细胞株（美国ATCC，4100-57）。

2 实验方法

2.1 制备含药血清

15只Wistar大鼠，雄性，SPF级，体重（500±20）g，根据体重分层随机分为正常组，厄贝沙坦组，糖肾平低、中、高剂量等5组，每组3只，依据人临床用药剂量，糖肾平各组分别按人临床用药剂量3.5倍（0.525 g/kg）、7倍（1.05 mg.kg-1）、14倍（2.1 g.kg-1）灌胃给药；厄贝沙坦组按人临床用药剂量7倍（17.5 g.kg-1）灌胃给药，给药组每天灌胃给药1次，正常组灌等量的生理盐水，连续灌胃7天，末次给药后2 h采血，分离血清，-20℃保存备用。

2.2 细胞复苏

取出冻存的细胞，在手中快速搓成冰水状，37℃水浴片刻；加无血清的164 0培养基10 mL，100 0 rpm离心3 min，弃上清，重复一次；加含10%胎牛血清的164 0培养基置于恒温CO2培养箱进行培养。

表1 实验分组及具体情况

2.3 细胞传代

培养箱取出培养瓶，镜下观察细胞生长至80%；0.25%胰蛋白酶1 mL，消化2 min，迅速移入超净台加1.2 mL含10%胎牛血清的1640培养基终止消化；转入15 mL离心管，100 0 rpm离心2 min，弃上清；加含10%胎牛血清的1640培养基，分装于新的细胞培养瓶继续培养。

2.4 实验分组

根据加入培养体系中血清的不同，分为正常组、高糖组、抑制剂（Y27632）组、厄贝沙坦组、糖肾平低剂量组（糖肾平低组）、糖肾平中剂量组（糖肾平中组）和糖肾平高剂量组（糖肾平高组），具体信息见表1。

2.5 倒置相差显微镜下观察小鼠肾小管上皮细胞形态的改变

将培养板置于显微镜载物台，目镜为10×，先用4×物镜观察，再用10×物镜观察肾小管上皮细胞形态，上下左右依次进行观察，统一选取培养板中央部位拍照。

2.6 MTT法检测细胞增殖

待细胞整体分布密度已经达到80%左右时，用0.25%的胰酶1mL消化细胞，6%FBS的RPMI 16401.3mL终止消化；按每孔200 μL6%FBSRPMI1640液3000个细胞种植于96孔培养板上，每组设8个复孔，4块复板，分加于加样孔中，置孵箱孵育24 h，吸出培养液，换无血清RPMI1640液每孔200 μL培养，同步24 h；吸弃培养基，按以上细胞分组情况加入各组相应的培养基成分，每组8个复孔；细胞继续培养12、24、48、60 h后取出细胞板，甩去培养基，每孔加入10 μL终浓度为5 mg·mL-1的MTT溶液及190 μL无血清1640培养基；继续培养4 h；甩去培养基，室温避光加入200 μL/孔的二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide,DMSO），轻轻震荡10 min；用450型自动酶标仪上检测各组细胞OD值（波长为492 nm）。

采用Western blotting检测各组肾小管上皮细胞中RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cadherin蛋白的表达。

一抗稀释浓度分别为：β-actin 1：2000、RhoA 1：500、ROCK1 1：500、α-SMA 1：2000、E-Cadherin 1：1000。电泳80 V，30 min左右，蓝色指示剂到达浓缩胶下缘时，调节电压为120V继续电泳1.5 h左右终止电泳。恒压转膜60 V 2 h[14]。

2.7 图像分析

采用Image J分析软件对Western blot图像进行分析。

2.8 统计学方法

实验结果采用xˉ±s表示，所有实验数据均采用SPSS 22.0进行单因素方差分析。

3 结果

3.1 小鼠肾小管上皮细胞形态

正常小鼠肾小管上皮细胞胞体呈扁平不规则多角形，中央圆形核，细胞融合呈鹅卵石状；高糖诱导下，细胞胞体呈梭形或不规则三角形，生长时呈放射状；相应含药血清干预后，细胞的形态由拉长的梭形或不规则三角形向扁平不规则多角形发展。结果见图1。

3.2 MTT法结果

各组加入相应的含药血清培养，24 h，与正常组相比，高糖组OD值升高（P＜0.01）；与高糖组比较，各治疗组均有不同程度的降低（P＜0.05）；48 h，与正常组比较，高糖组升高（P＜0.01）；与高糖组比较，各治疗组均有不同程度的降低，糖肾平高剂量组（P＜0.05），其余各治疗组（P＜0.01）；与与Y27632组、厄贝沙坦组和糖肾平高剂量组比较，糖肾平低剂量组和中剂量组OD值降低（P＜0.05）；60 h，与正常组比较，高糖组升高，（P＜0.01）；与高糖组比较，各治疗组均有不同程度的降低（P＜0.05），；与厄贝沙坦组比较，糖肾平各剂量组降低（P＜0.05）；与Y27632组比较，糖肾平中剂量组降低；与糖肾平高剂量组比，糖肾平低剂量组升高（P＜0.05），见表2。

3.3 RhoA和ROCK1蛋白表达

高糖组肾小管上皮细胞内RhoA和ROCK1蛋白表达明显高于正常组（P＜0.01）；与高糖组比，厄贝沙坦组和Y27632组ROCK1表达降低（P＜0.01），厄贝沙坦组RhoA表达也降低（P＜0.01），糖肾平含药血清各治疗组肾小管上皮细胞中RhoA和ROCK1蛋白表达较少，高剂量组疗效最优（P＜0.01）。

图1 各组小鼠肾小管上皮细胞形态及增殖情况（×100）

表2 糖肾平含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞12、24、48 h、60 h增殖的影响（xˉ±s，n=7，OD值）

3.4 α-SMA和E-Cadherin蛋白表达

与正常组相比，高糖组肾小管上皮细胞中E-钙黏素（E-Cadherin,E-Cad）蛋白表达减少，α平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin，α-SMA）蛋白表达增加（P＜0.01）；与高糖组比，厄贝沙坦组和Y27632组α-SMA蛋白表达明显降低，E-Cadherin蛋白表达增多（P＜0.01）；与高糖组相比，糖肾平高剂量组肾小管上皮细胞中α-SMA蛋白表达降低，E-Cadherin蛋白表达增加（P＜0.01），在各剂量组中效果最优。（表3、图2）。

表3 糖肾平对高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞RhoA/ROCK通路蛋白表达的影响（OD，xˉ±s）

图2 糖肾平对高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞RhoA、ROCK1、α-SMA、E-CAD蛋白表达的影响

4 讨论

DKD时，高糖、氧化应激和血流动力学异常等引起肾小管上皮细胞结构损伤及功能障碍，受损伤的细胞增殖能力增强，增殖后的细胞有两种发展方向，可通过细胞增殖产生与损伤前细胞类型相同的细胞，对受损伤的肾小管上皮细胞进行补充；或者在增殖后进一步发生上皮-间质转分化，形成成纤维细胞从基膜迁移到肾间质，并分泌大量细胞外基质以及分泌致纤维化生长因子加重肾脏异常免疫应答反应，从而加重DKD肾脏损伤和病情恶化[6-8]。因此，通过抑制肾小管上皮细胞增殖，能够在一定程度上抑制其转分化；伴随着上皮-间质转分化现象的出现，与转分化密切相关的信号转导通路如RhoA/ROCK等被激活，加剧DKD的病理进程[9-11]，高糖可激活RhoA/ROCK通路，介导EMT的发生[12]。RhoA为小分子鸟苷酸结合蛋白，起“分子开关”的作用，ROCK1是其最重要和最直接的效应分子[13,14]。

导师赵宗江教授提出的DKD“肾痿”假说认为DKD日久，则热、郁、痰湿、瘀血、毒邪相互胶结于肾脏，阻滞气血运行，使肾脏的结构破坏，“肾体”受损，结构是功能正常行使的前提和基础，“肾体”受损，肾脏的结构破坏必然最终导致肾脏正常功能受损甚至丧失，即“肾用”失常，“肾体”和“肾用”均受到损害，肾脏痿废不用，发为“肾痿”，其不仅概括了病机，也描述了疾病的最终状态。“肾痿”与诸多脏腑有关，与肝、脾、肾三脏关系最为密切，尤以脾肾最为关键。该病本为阴虚燥热，若失治误治，导致病情进一步发展，既损伤阴津，又耗损正气，正气日渐耗而致气阴两虚；病变中晚期，肾精亏虚，精不化血，日久阴损及阳，继而发展为脾肾阳虚，脾胃虚弱，生化乏源，导致血虚，形成气血亏虚，最后导致五脏之气皆虚，气血阴阳俱衰。实证方面，因肾气不足，不能气化和通调水道而致水湿停留，湿郁久化热，湿热内蕴，毒瘀结聚于肾，发为本病，故本病病性总属本虚标实，但临床上虚实夹杂的情况非常多见。虚则以正气亏虚为本，实则以痰浊、湿热、瘀毒结聚为标，并且贯穿于“肾痿”整个发展过程，其中瘀血是引起并导致DKD“肾痿”不断发展的最关键致病因素。许慎《说文解字》中说，“瘀，积血也”，消渴肾病迁延日久，阴虚燥热耗伤气阴，导致气阴两虚，结合“久病入络”理论，气虚则行血无权，阴虚则火旺伤津，血行瘀滞，初为气阴两虚，后由虚致实，瘀血内生，阻滞肾络[15]，反映在肾脏病理表现上则可见肾小球硬化，肾小管上皮细胞重吸收障碍，空泡样变，间质纤维化等。在“肾痿”假说的指导下组方的糖肾平，药物组成有生黄芪、熟地黄、山萸肉、白花蛇舌草、翻白草、水蛭。方中黄芪能健脾益气、利水消肿、固摄精微、减少尿蛋白，为方之君药；山萸肉、熟地黄共同补益肝肾、生津益气为臣药；白花蛇舌草、翻白草清热解毒、消痛散结、利尿除湿为佐药；水蛭为使，活血通经，以引诸药直达肾络。全方以滋补肝肾、益气固精为主，兼以活血化瘀通肾络，全方补而不滞，祛瘀而不伤正，治疗DKD之气阴两伤、瘀血阻络、精微下泄者效果尤其显著。

本实验结果表明，12 h时作用时间较短，高糖的诱导作用和药物的干预作用还未能充分显现出来；24 h高糖诱导下的肾小管上皮细胞增殖活跃，各个药物对高糖诱导下的肾小管上皮细胞增殖有不同程度的抑制作用，但各自的药物作用特点尚未显现；48 h糖肾平低、中剂量对细胞增殖的抑制作用较强；60 h糖肾平中剂量组对高糖诱导下的肾小管上皮细胞增殖的抑制作用最强E-cadherin是维持上皮细胞完整性和极性最重要的组件之一，α-SMA是间充质细胞标志物，RhoA/ ROCK通路激活可致E-cadherin表达减少，有利于肾小管上皮细胞迁移至肾间质，发生表型转变后形成肌成纤维细胞，大量表达α-SMA。ROCK特异性抑制剂Y27632通过抑制ROCK活性来抑制转分化时RhoA/ ROCK信号通路的激活，上调E-Cadherin的表达，下调α-SMA的表达，从而抑制EMT过程。高糖诱导的小鼠肾小管上皮细胞RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白呈现高水平表达，而与此同时E-Cadherin蛋白呈现低水平表达，糖肾平含药血清可以降低高糖诱导的小鼠肾小管上皮细胞RhoA和ROCK1蛋白表达并且降低α-SMA蛋白表达水平，升高肾小管上皮细胞标志蛋白ECadherin蛋白表达水平，糖肾平高剂量组效果最优。糖肾平对小鼠肾小管上皮细胞增殖有明显的抑制作用，细胞增殖可能参与了上皮-间质转分化的过程。因此，糖肾平通过抑制细胞增殖和RhoA/ROCK信号转导通路，可以逆转肾小管上皮细胞转分化过程，抑制DKD肾间质纤维化，延缓其病情进展。糖肾平是中药复方制剂，其多靶点作用机制有待进一步实验证实。

1Liu Y,Song Y,Tao L,et al.Prevalence of diabetic retinopathy among 13473 patients with diabetes mellitus in China:a cross-sectional epidemiological survey in six provinces.Bmj Open,2017,7(1): e013199.

2王之琳,赵宗江.赵宗江教授治疗糖尿病肾病的学术思想及临床经验撷英.世界科学技术-中医药现代化,2015,17(10):2162-2166.

3吴阿敏.糖肾平对糖尿病肾病KKAy小鼠肾脏保护作用及TGF-β1/ Samd6/BMP7信号转导通路影响的研究.北京:北京中医药大学硕士学位论文,2016:60-62.

4Huang S,Susztak K.Epithelial plasticity versus EMT in kidneyfibrosis. Trends Mol Med,2016,22(1):4-6.

5江罗佳,秦晓华,黄翀,等.重组人促红细胞生成素治疗肾间质纤维化的作用机制研究.中国全科医学,2016,19(6):672-677.

6段玉蕊,杨素霞,陈宝平.冬虫夏草胶囊联合替米沙坦片对糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞转分化的调节作用.中国临床药理学杂志, 2016,32(23):2170-2173,2177.

7Jia W,Tong N.Diabetes prevention and continuing health-care reform in China.Lancet Diabetes Endocrinol,2015,3(11):840-842.

8Afkarian M,Zelnick L R,Hall Y N,et al.Clinical manifestations of kidney disease among US adults with diabetes,1988-2014.JAMA, 2016,316(6):602-610.

9李相辉.复方鳖甲软肝方调节细胞外基质降解平衡防治肾间质纤维化的实验研究.北京:北京中医药大学硕士学位论文,2006:21-23.

10 Schofield A V,Bernard O.Rho-associated coiled-coil kinase(ROCK) signaling and disease.Crit Rev Biochem Mol Biol,2013,48(4):301-316.

11 Zhu J,Nguyen D,Ouyang H,et al.Inhibition of RhoA/Rho-kinase pathway suppresses the expression of extracellular matrix induced by CTGF or TGF-βin ARPE-19.Int J Ophthalmol,2013,6(1):8-14.

12 David M,Petit D,Bertoglio J.Cell cycle regulation of Rho signaling pathways.Cell Cycle,2012,11(16):3003-3010.

13 Zhang K,Zhang H,Xiang H,et al.TGF-β1induces the dissolution of tight junctions in human renal proximal tubular cells:role of the RhoA/ ROCK signaling pathway.Int J Mol Med,2013,32(2):464-468.

14Boonla C,Krieglstein K,Bovornpadungkitti S,et al.Fibrosis and evidence for epithelial-mesenchymal transition in the kidneys of patients with staghorn calculi.Bju Int,2011,108(8):1336-1345.

15赵宗江,豆小妮,张新雪.糖尿病肾病“肾痿”假说探讨.中医杂志, 2011,52(S1):8-10.

Effect of Tangshenping Medicated Serum on Proliferationand RhoA/ROCK Signaling Pathway of High Glucose-induced Epithelial Cells of Renal Tubules

Miao Yonghui,Zhao Zongjiang,Yang Guannan,Wang Ting,Huang Yawei,Zhang Ziyan
(College of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

To study the effect of the Tangshenping containing serum on the proliferation of the high glucose-induced epithelial cells of renal tubules.To prepare durg-contained serum from rats to enter into in vitor reaction system,the cellscultured via 10%FBS-RPMI 1640 were randomly divided into 7groups:the normal group,themodel group,the Y27632 group,theirbesartangroup,the small dose Tangshenping group,the medium dose Tangshenping group and the high dose Tangshenping group and The cells were cultured in 3000 cells/well and grown in 96-well plates.Each group had 8 wells,then detect the effects of all serum sections on the proliferation of high glucose-induced epithelial cells of kidney tubules by the MTT colorimetric method after cultured for 12 h,24 h,48 h,and 60 h.Based on the results above, cell protein were extracted from each group at 24 h,and the expression of RhoA,ROCK1,α-SMA and E-cadherin in each group were detected by Western blotting.After high glucose stimulation,the shape of cell was shuttle-like or irregular triangle,the way it grew was radial;after the intervention of the corresponding serum,the shape of the cell was flat and irregular polygonal.Started with 12h,compared with the normal group,OD value of other groups increased;at the 24h、48hand 60h,compared with the normal group,OD value of high glucose groupincreased significantly(P＜0.01); compared with the high glucose group,OD value of treatment groups decreased(P＜0.05);and 48 h,compared with the Y27632group,irbesartan groupand Tangshenping high dose group,OD value of Tangshenping low and medium dose groups decreased(P＜0.05);60 h,compared with Y27632 group,OD value of Tangshenping medium dose groups decreased;compared with irbesartan group,OD value of o Tangshenpinggroupsdecreased(P＜0.05);compared with Tangshenping high dose group,OD value of Tangshenpinglow groupsdecreased(P＜0.05)Western blotting analysis showed that compared with normal group,the expression of E-Cadherin protein in high glucose group reduced,and the expression of RhoA,ROCK1 and α-SMA protein increased;compared with high glucose group,the expression of ECadherin protein in each treating group increased,and the Tangshenping large dose group wassignificantly different(P＜0.01);the expression of RhoA,ROCK1 and α-SMA protein reduced,Tangshenping,the large dose group was significantlydifferent(P＜0.01);Compared with the Y27632 group,the expression of E-cadherin,ROCK1 and α-SMA protein in Tangshenping large dose group had no significant difference,while the expression of RhoAproteinreduced(P＜0.01).Compared with theirbesartan group,the expression of E-cadherin,RhoA,ROCK1 and α-SMA protein in Tangshenping large dose group had no significant difference(P＞0.05).The Tangshenping containing serum is abletoinhibit the proliferation of high glucose-induced epithelial cells of kidney tubules,and can reverse renal tubular-epithelial cell transdifferentiation via regulating RhoA/ROCK signaling pathway,and restrain renal interstitial fibrosis,thereby delaying the pathogenesis of diabetic kidney disease.

Tangshenping,consumptive kidney disease,renal tubular epithelial cellline,KKAy Mouse,cell proliferation, MTT,EMT,RhoA/ROCK signaling pathway

10.11842/wst.2017.06.026

R285.5

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：王晶）

2017-06-01

修回日期：2017-04-20

＊国家自然基金委面上项目（81373831）：基于“肾痿”组方的糖肾平干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化的分子机制研究，负责人：赵宗江。

＊＊通讯作者：赵宗江，本刊编委，教授，博士生导师，主要研究方向：中医药防治糖尿病肾病的机制研究；苗永辉，硕士研究生，主要研究方向：中医药防治糖尿病肾病的机制研究。