人参皂苷Rg1对β淀粉样蛋白诱导的神经细胞凋亡的研究

叶茂盛 赵东杰 周勇 蒋蓝英

人参皂苷Rg1对β淀粉样蛋白诱导的神经细胞凋亡的研究

叶茂盛 赵东杰 周勇 蒋蓝英

目的探讨人参皂苷Rg1对大鼠海马组织β淀粉样蛋白（Aβ）诱导的神经细胞凋亡的影响。方法36只SD雄性大鼠分为假手术组、Aβ模型组和人参皂苷Rg1干预组。Aβ模型组和人参皂苷干预组直接注射10μg/μL的β淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）1μL于大鼠海马组织造模；人参皂苷干预组大鼠术后用人参皂苷Rg150mg/kg连续灌胃30天。采用Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力，甲醇刚果红染色观察人参皂苷Rg1对海马组织Aβ的沉积影响，TUNEL法检测海马神经细胞凋亡。结果假手术组大鼠水迷宫测试逃避潜伏时间为（47.36±12.21）s，穿越平台次数为（7.48±1.25）次。与假手术组比较，Aβ模型组大鼠水迷宫测试逃避潜伏时间延长至（84.52±16.68）s（P<0.01），穿越平台次数减少至（2.57±0.64）次（P<0.01）。与Aβ模型组比较，人参皂苷干预组大鼠的逃避潜伏时间[（63.22±12.05）s，P<0.05]和穿越平台次数[（5.22±1.31）次，P<0.05]均显著改善。Aβ模型组大鼠海马组织出现明显Aβ沉积；人参皂苷干预组大鼠海马组织Aβ沉积的阳性斑块数量少于Aβ模型组。人参皂苷干预组海马组织TUNEL阳性神经细胞数目比Aβ模型组明显减少[（73.20±1.71）个比（101.83±1.45）个，P<0.01]，Aβ模型组海马组织细胞出现明显的细胞凋亡。结论人参皂苷Rg1可明显改善Aβ所致AD大鼠学习记忆功能，减少海马组织的Aβ沉积，抑制大鼠海马Aβ诱导的细胞凋亡。

大鼠；阿尔茨海默病；海马组织；人参皂苷；β-淀粉样蛋白；细胞凋亡

阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD）是一种进展性认知功能恶化伴日常生活能力下降和行为能力改变的神经系统疾病，临床表现为认知、语言、动作、精神行为障碍。发病率与年龄相关，老年人发病率较高。目前尚无治疗AD的特效药，因此，其已经成为医疗界的挑战之一[1]。世界卫生组织报告[2]，2010年全球范围内＞60岁人群老年痴呆的患病率为4．7%，人参皂苷可延缓神经细胞衰老并降低老年人发生记忆损伤的风险，且具有稳定膜结构和增加蛋白质合成作用，可以提高老年人记忆能力。有研究[3]显示，人参皂苷Rg1对神经系统具有一定的保护作用。AD病理学改变主要在细胞外有β淀粉样蛋白（β－amyloid peptide，Aβ）沉积形成老年斑，在细胞内则有tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结[4]。本实验观察人参皂苷Rg1对大鼠海马Aβ沉积及细胞凋亡等影响，探讨人参皂苷Rg1对AD大鼠的防治作用。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器Aβ1－42购自美国Sigma－Aldrich公司（No．043K49511），人参皂苷Rg1（纯度＞95%，批号：12080421）购自上海同田生物技术有限公司；TUNEL细胞凋亡试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。图像分析系统，动物脑立体定位、Morris水迷宫系统由浙江中医药大学实验室提供。

1.2 动物分组及干预健康SD大鼠36只，雄性，体质量180～220g，由浙江中医药大学动物实验室提供，动物实验条件合格证：SYXK（浙）2013－0184。大鼠按随机数字表分为假手术组、Aβ模型组和人参皂苷干预组，每组各12只，按文献[5－6]方法采用海马注射Aβ1－42建立动物模型：选择右侧海马CA1区为注射靶区，定位坐标为前囟后（AP）3．0mm，右侧旁开（ML）2．2mm，硬脑膜下（DV）2．8mm。用牙科钻钻开颅骨，微量注射器自硬脑膜表面垂直进针，以微量注射器注射Aβ1－42溶液1μL（浓度为10μg/μL），控制注射速度为0．2μL/min，注射完后留针2min以保证溶液充分弥散，然后缓慢撤针，皮肤切开处用庆大霉素点滴，缝合切口。假手术组：于大鼠右侧海马区注射灭菌生理盐水，术后生理盐水连续灌胃30天。Aβ模型组：于大鼠右侧海马区注射Aβ1－42，术后生理盐水连续灌胃30天。人参皂苷干预组：于大鼠右侧海马注射Aβ1－42，术后用人参皂苷Rg1（50mg/kg）连续灌胃30天。

1.3 学习记忆能力测定SD大鼠术后2周，将三组大鼠按参考文献[5，7]方法适当修改后进行Morris水迷宫测试，每组SD大鼠每天训练3次，每次120s，连续训练6天，记录120s内寻找到隐藏在水面下平台的时间（逃避潜伏时间），并允许SD大鼠在平台上停留30s以达到强化记忆效果。第7天撤除平台，任选一个入水点将SD大鼠放入水中，游泳180s，记录大鼠在180s内穿过目标（原平台所在位置）的次数。

1.4 标本制作、观察指标用10%水合氯醛腹腔麻醉，从左心室把灌注针插到大鼠主动脉根部，用丝线结扎，以防脱落。然后切开右心房放血，先以37°C生理盐水冲洗，再以4%多聚甲醛PBS溶液灌注固定，剥离出脑组织，并置于4°C的4%多聚甲醛溶液固定48h以上，然后将大脑组织石蜡包埋，制片。取大鼠海马组织切片进行甲醇刚果红特殊染色观察Aβ沉积情况。按TUNEL法检测细胞凋亡：取切片常规二甲苯脱蜡，经乙醇水合后，将切片浸入3%H2O2封闭液中室温封闭，用胰蛋白酶（0．5%HCl溶液）37°C孵育45min，PBS漂洗2次，将样本周围吸干，滴加25μL的TUNEL反应混合溶液，在湿盒中37°C孵育60min，PBS漂洗2次。滴加DAB底物溶液，室温孵育30min，PBS再次漂洗，最后显微镜下检测。TUNEL阳性凋亡细胞表现为细胞核染成棕黄色，细胞核大小不一致，形态不规则。普通光镜下计数神经细胞凋亡，分别用海马CA1区神经细胞密度1mm长度的凋亡神经细胞数量表示，定量采用显微镜计数法（400倍视野），各组动物每张切片随机抽取5个不相重复的视野计数各组TUNEL平均阳性细胞数[8]。

1.5 统计学方法应用SPSS13．0软件协助完成，计量资料以均数±标准差（） 表示，两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采用方差分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫测试结果与假手术组比较，Aβ模型组大鼠逃避潜伏时间显著延长（P＜0．01），穿越平台次数显著减少（P＜0．01）。与Aβ模型组比较，人参皂苷Rg1干预治疗后，大鼠的逃避潜伏时间和穿越平台次数均得到显著改善，差异有统计学意义（P< 0.05，P<0.01），显示人参皂苷Rg1能够改善大鼠学习和记忆功能，见表1。

表1 三组SD大鼠Morris水迷宫实验结果比较（）

表1 三组SD大鼠Morris水迷宫实验结果比较（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与Aβ模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别假手术组Aβ模型组人参皂苷组鼠数121212逃避潜伏时间（s）47.36±12.2184.52±16.68** 63.22±12.05*△穿越平台次数（次）7.48±1.252.57±0.64** 5.22±1.31*△△

2.2 甲醇刚果红染色结果观察假手术组大鼠大脑组织切片无明显染色阳性物质沉积，Aβ模型组和人参皂苷干预组大脑组织切片甲醇刚果红染色中均可以见到染色阳性（嗜红色或者砖红色）物质沉积，提示存在Aβ沉积。人参皂苷干预组大鼠海马组织阳性斑块少于Aβ模型组，见图1（封二）。

2.3 细胞凋亡结果观察TUNEL法检测显示阳性凋亡细胞胞核呈棕黄色，典型凋亡细胞为指环样结构，胞核大小不一致，形态不规则，核固缩染成深棕色，由于细胞凋亡时细胞核的DNA可渗透到胞浆，所以部分凋亡细胞胞浆也有着色。假手术组TUNEL阳性神经细胞数目较少，为（10.46±0.27）个／高倍镜视野。人参皂苷干预组大鼠海马组织TUNEL阳性神经细胞数目达（73.20±1.71）个／高倍镜视野，但明显少于Aβ模型组的（101.83±1.45）个／高倍镜视野（P＜0.01）。人参皂苷干预组大鼠海马组织凋亡细胞数比Aβ模型组明显减少（P＜0.01），表明细胞凋亡参与海马神经元丢失，人参皂苷Rg1可降低Aβ所诱导的细胞凋亡，见图2（封二）。

3 讨论

阿尔茨海默病（AD）的病因及发病机制尚不明确，Aβ是构成AD主要病理特征“老年斑”的主要成分，Aβ的异常沉积及对神经细胞的毒性作用，被认为是AD形成和发展的关键因素之一。Aβ1-42在相关肽类中神经毒性较强，可引起炎症反应和细胞凋亡[9]。海马被认为是学习记忆的神经中枢，海马神经细胞数量减少、形态异常或功能失调，可导致一系列神经退行性疾病。

人参具有安神益智等功效，人参皂苷Rg1是人参的主要有效成分之一，多种致痴呆模型实验显示其能明显改善学习记忆能力[3]。本实验也表明，人参皂苷能显著改善AD大鼠的学习记忆能力，减少海马组织Aβ沉积，具有较强的神经保护作用。水迷宫实验结果显示人参皂苷Rg1治疗干预组逃避潜伏时间和穿越平台次数明显优于Aβ1-42模型组（P< 0.01），表明人参皂苷Rg1可显著改善AD大鼠的空间学习记忆能力，这与陈志勇等[10]报道的人参皂苷可改善海马损伤大鼠的学习记忆功能相符合。人参皂苷Rg1还可能通过抑制β-分泌酶的表达而达到减少淀粉样前体蛋白（APP）的产生，提高模型大鼠学习记忆能力[11]。人参皂苷Rg1还能激活核蛋白因子κB（NF-κB），促进NF-κB的核转位，导致β分泌酶的活性降低[12]。

研究[13-15]表明，人参皂苷Rg1还可以通过促进B淋巴细胞瘤/白血病-2及其相关X蛋白（Bcl-2/ Bax）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）等表达从而抑制神经细胞凋亡。死亡信号的转导依赖于死亡配体与受体的结合（如肿瘤坏死因子TNF-α及其受体TNFR，Fas及其配体FasL），接着死亡受体的死亡结构域与信号转导分子（FADD）结合，而FADD又可与caspase-8酶原的死亡结构域相连接，形成死亡诱导信号复合物，激活caspase-8，使线粒体释放细胞色素C，或直接作用于caspase-3及其他下游的caspase引发凋亡[16]。人参皂苷Rg1还参与了信号转导通路活性的调节，从而减少细胞凋亡[17-18]。人参皂苷Rg1可能通过减轻免疫炎症反应、清除AD大鼠海马内自由基，下调Caspase-3的表达，从而抑制Aβ诱导的神经细胞凋亡，这可能是其抗凋亡发挥神经保护的作用机制之一，其抑制神经细胞凋亡的具体机制，有待进一步研究。

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（收稿：2017-04-12修回：2017-05-10）

Effect of Ginsenoside Rg1 on β-amyloid InducedNeuron Apoptosis

YE Maosheng,ZHAO Dongjie,ZHOU Yong,JIANG LanyingDepartment of Gerontology,Hospital of Integrated TCM and Western Medicine of Zhejiang Province,Hangzhou(310003),China

ObjectiveTo investigate the effect of ginsenoside Rg1 on β-amyloid（Aβ）inducedneuron apoptosis in the hippocampusarea.MethodsThirty-six Sprague-Dawley rats were assigned into 3 groups.Rats in the shamoperated group were injected with normal saline.Rats in the Aβ group and ginsenoside Rg1 group were injected with 1μL Aβ1-42at the concentration of 10μg/μL.Rats in the ginsenoside Rg1 group were fed with ginsenoside Rg1 solution of 50mg/kg for 30 days consecutively.The Morris water maze was used to assess the ability of learning and memory in rats.The effect of Aβ and ginsenoside Rg1 on the hippocampus cells was observed by Congo red staining of methanol.The apoptotic neurons were detected by TUNEL method.ResultsThe escape latency of rats was（47.36±12.21）s and and the number of rats crossing platform was（7.48±1.25）in the sham-operated group, which increased to 84.52±16.68s and and 2.57±0.64 in the Aβ group respectively.Compared with Aβ group,the escape latency（63.22±12.05）s of rats was decreasedand the number of rats crossing platform（5.22±1.31）was increased in the ginsenoside Rg1 groupsignificantly（both P<0.05）.The Aβ peptide deposition was found in the hippocampus ofrats.More positive staining materials aggregated in the Aβ group compared with the ginsenoside Rg1 group by Congo red staining.The apoptotic neurons inthe hippocampus of rats in Aβ injection group were increased significantly.The number of TUNEL positive neuron in the hippocampus of ginsenoside Rg1 group wasfewer than that in the Aβ group（73.20±1.71 vs 101.83±1.45,P<0.01）.ConclusionGinsenoside Rg1 can reduce the de－position of Aβ in the hippocampus and improve the learning and memoryfunction of rats by reducing the Aβ－induced apoptosis in the hippocampus．

rats;Alzheimer's disease;ginsenoside;β－amyloid peptide;apoptosis

book=642,ebook=10

浙江省中医药科技计划项目（No.2010ZB112）

浙江省中西医结合医院老年病科（杭州310003）

叶茂盛，Tel：15068892185；E-mail：maoshengyea@126.com