基于特征图谱及多指标成分含量的云南重楼野生与栽培品比较研究

2017-08-30昝珂高宇明崔淦刘杰过立农郑健

中国中药杂志 2017年15期

昝珂高宇明崔淦刘杰过立农郑健马双成

[摘要]对云南重楼野生和栽培品的HPLC特征图谱和主要皂苷含量进行比较，分析化学成分差异。以重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ等9种成分为对照品，采用Waters XSelect HSS T3 C18 （46 mm×250 mm， 5 μm）；乙腈（A）水（B）为流动相，梯度洗脱（0～50 min，30%～50%A；50～80 min，50% A，80～85 min，50%～30%A；85～100 min，30% A），流速1 mL·min-1，检测波长为203 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，建立云南重楼野生品和栽培品的特征图谱，并同时测定9种甾体皂苷的含量。野生品中重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H的平均含量高于栽培品；重楼皂苷I的平均含量低于栽培品；4种偏诺皂苷平均含量总和显著高于栽培品；5种薯蓣皂苷平均含量总和显著低于栽培品。云南重楼栽培品和野生品化学成分具有一定的差异，使用中应通过更多药理和临床试验进一步研究。

[关键词]云南重楼；野生；栽培；特征图谱；甾体皂苷；高效液相色谱；含量测定

Comparative study on specific chromatograms and main active components of

wild and cultivated rhizomes of Paris polyphylla var yunnanensis

ZAN Ke1， GAO Yuming2， CUI Gan3， LIU Jie1， GUO Linong1，

ZHENG Jian1*， MA Shuangcheng1*

（1 National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China；

2 Ziyang Institute for Food and Drug Control， Ziyang 641300， China；

3 School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China）

[Abstract]The present study is to compare specific chromatograms and main acitive components between wild and cultivated rhizomes of Paris polyphylla var yunnanensis by HPLC HPLC analysis was performed on a Waters XSelect HSS T3 C18 clumn （46 mm×250 mm， 5 μm）， with a mobile phase consisting of acetonitrile （A）water （B） at a flow rate of 1 mL·min-1 （050 min，30%50%A；5080 min，50% A，8085 min，50%30%A；85100 min，30% A） The detection wavelength was 203 nm and the column temperature was controlled at 30 ℃， and the injection volume was 10 μL HPLC specific chromatograms of wild and cultivated rhizomes of P polyphylla var yunnanensis were established and nine steroidal saponins were simultaneously determined by the above method The mean contents of paris saponin Ⅶ， paris saponin H and total average contents of four pennogenyl saponins in Rhizomes of wild samples were significantly higher than those of cultivated ones However， this result is opposite from the average content of paris saponin Ⅰ and total average contents of five dioscins in the wild and cultivated samples Because the significant differences occurred for the specific chromatograms and main active components between the wild and cultivated P polyphylla var yunnanensis， much more pharmacological and clinical researches are therefore necessary.

[Key words]Paris polyphylla var yunnanensis； wild； cultivated； specific chromatograms； steroidal saponins； HPLC； content determination

重楼是《中国药典》2015年版一部收录品种，根茎入药，具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊的功效[1]，是云南白药、宫血宁和季德胜蛇药等中成药的重要原料。云南重楼Paris polyphylla Smith var yunnanensis（Franch） HandMazz是重楼的基原植物之一。因使用量不断加大，生长周期较长，野生资源过度采集，现已趋于枯竭，目前市场上以栽培品为主。据文献报道，甾体皂苷是重楼中的主要活性成分，现已从重楼属植物中分离鉴定200多个甾体皂苷类成分，其苷元主要有薯蓣皂苷元、偏诺皂苷元。本研究中重楼皂苷Ⅶ，D，H，Ⅵ属于偏诺皂苷；重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，薯蓣皂苷，纤细薯蓣皂苷属于薯蓣皂苷[27]。采用HPLC或UPLC法测定重楼中甾体皂苷类成分有一些报道。目前，《中国药典》含量测定项下控制重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ 共4种成分的总含量不少于060%。鄒亮等[8]采用HPLC测定了不同产地云南重楼中的4种重楼皂苷；李懿等[9]采用HPLC测定了云南重楼的6种皂苷。王永慧等[10]采用UPLC测定重楼药材中重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的含量；韩燕全等[11]采用UPLCELSD测定4种皂苷成分；张绍山等[12]采用UPLCELSD测定了云南重楼中7种甾体皂苷含量。本研究采用HPLC建立云南重楼野生品和栽培品的特征图谱，并同时测定重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ共9种甾体皂苷的含量，为野生和栽培品的质量评价提供参考。

1材料

11仪器

1260型高效液相色谱仪（安捷伦公司），二极管阵列检测器（安捷伦公司），QUINTIX3131CN型1/1万电子天平（Sartorius公司），MSE125S型1/10万电子天平（Sartorius公司），KQ300DV型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司），MilliQ纯水仪（密理博公司）。

12试药

对照品重楼皂苷Ⅶ（批号111593201303），重楼皂苷Ⅱ（批号111591201103），重楼皂苷Ⅵ（批号111592201303），重楼皂苷Ⅰ（批号111590201103）由中国食品药品检定研究院提供；对照品重楼皂苷H（批号C20J7G16481）由上海源叶生物科技有限公司提供；重楼皂苷D（批号151105）和重楼皂苷Ⅴ（批号150716）由成都普菲德生物技术有限公司提供，薯蓣皂苷（批号15110210）和纤细薯蓣皂苷（批号15181110）由北京中科质检生物技术有限公司提供，HPLCDAD（面积归一化法）检测纯度均大于980%。甲醇和乙腈为色谱纯（Fisher公司），试验用水为超纯水。

13药材

药材采自产地，编号1～10为野生品，编号11～20为野生品。样品经中国食品药品检定研究院民族药室郑健研究员鉴定为百合科云南重楼P. polyphylla var. yunnanensis的干燥根茎。

2溶液的制备

21混合对照品溶液的制备

取重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ对照品适量，精密称定，用甲醇溶解配制成上述9种成分分别含2 042，985，475，1 051，921，856，1 041，915，1 031 mg·L-1的混合对照品储备液。取各对照品储备液适量加甲醇配制成上述9种成分分别为1021，9850，4750，5255，4605，4280，5205，4575，5155 mg·L-1的混合溶液，即得。

22供试品溶液的制备

取本品粉末（过4号筛）05 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足失重，摇匀，用022 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

3色谱条件与系统适用性

色谱柱Waters XSelect HSS T3 C18（46 mm×250 mm，5 μm）；乙腈（A）水（B）为流动相，梯度洗脱（0～50 min，30%～50%A；50～80 min，50% A，80～85 min，50%～30%A；85～100 min，30% A），流速1 mL·min-1，检测波长为203 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

4特征图谱

41云南重楼特征图谱的建立

取云南重楼野生品（样品1～10）和栽培品（样品11～20）粉末，精密称定，按22项方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，分别进样测定，记录80 min的HPLC色谱图（图1，2）。根据结果，采用Chempattern化学计量学软件进行数据分析处理，设定样品1为参照图谱，将野生品的色谱峰与参照图谱进行自动匹配，生成云南重楼野生品的特征图谱（图3）；以样品11为栽培品的参照图谱，将栽培品的色谱峰与参照图谱进行自动匹配，生成云南重楼栽培品的特征图谱（图4）。

42特征峰的标定

根据10批云南重楼野生品的特征图谱检测结果，共标定9个特征峰。经过与对照品比对，可知1号峰为重楼皂苷Ⅶ，2号峰为重楼皂苷D，3号峰为重楼皂苷H，4号峰为重楼皂苷Ⅵ，5号峰为重楼皂苷Ⅱ，6号峰为薯蓣皂苷，7号峰为纤细薯蓣皂苷，8号峰为重楼皂苷Ⅰ，9号峰为重楼皂苷Ⅴ。

43方法学考察

431精密度试验精密吸取同一云南重楼供试品溶液（样品1）10 μL，按上述色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图。以重楼皂苷Ⅰ为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD<1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD<2%，采用科迈恩（北京）科技有限公司Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度为099，结果表明仪器精密度良好。

432稳定性试验精密吸取同一云南重楼供试品溶液（样品1）10 μL，分别于0，2，4，6，8，12，24 h按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。以重楼皂苷Ⅰ为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD<1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD<2%，采用Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度为099，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

433重复性试验取同一批云南重楼样品粉末（样品1）6份，精密称定，按22项方法分别制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，分别进样测定，记录色谱图。以重楼皂苷I为参照峰，计算特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果各特征峰的相对保留时间的RSD<1%，单峰面积占总峰面积大于2%的特征峰的相对峰面积RSD<2%，采用Chempattern化学计量学软件进行评价，相似度为099，结果表明，该方法重复性好。

44野生品和栽培品特征图谱比较

从建立的特征图谱比较，野生品中峰1～3、峰7均高于栽培品；峰8低于栽培品，峰6和9基本相同，峰4含量均较低。以云南重楼野生品的共有模式為参照图谱，采用Chempattern化学计量学软件，夹角余弦法计算相似度，野生品1～10的相似度分别为0574，0922，0888，0922，0597，0602，0620，0936，0655，0906；栽培品11～20的相似度分别为0793，0904，0473，0664，0751，0887，0631，0680，0719，0815。从相似度分析，云南重楼野生品和栽培品之间差别较大，但由于野生品和栽培品组内差异也较大，从相似度无法区分野生品和栽培品。

5含量测定

51系统适用性试验

按3项色谱条件进行检测，以重楼皂苷Ⅰ计算理论塔板数大于6 000，分离度大于15，对照品溶液及供试品溶液的色谱图（图5）。

52方法学考察

521线性关系考察精密吸取混合对照品储备液01，05，10，20，40 mL分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得2～6号混标溶液；再取1号混标溶液2 mL置10 mL量瓶中用甲醇定容至刻度，摇匀，即得1号混标溶液。分别精密吸取上述1～6号混标溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，以各对照品质量浓度（mg·L-1）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（表1），表明各化合物在相应线性范围内线性关系良好。

A 混合对照品溶液； B 野生品； C 栽培品。

522精密度试验精密吸取21项混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ的峰面积的RSD分别为056%，045%，072%，063%，075%，041%，052%，063%，065%（n=6），表明仪器精密度良好。

523重复性考察取样品粉末（野生样品1）6份，分别按照22项方法制备供试品溶液，按3项色谱方法测定，记录峰面积，计算含量。结果各份供试品溶液的重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ的测定结果RSD（n=6）分别为11%，13%，14%，15%，093%，13%，086%，094%，17%，结果表明重复性良好。

524溶液稳定性试验取同一份供试品溶液（野生样品1），分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定。结果重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅰ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ的峰面积的RSD（n=6）分别为032%，068%，075%，091%，035%，045%，074%，055%，081%，結果表明供试品溶液在24 h内稳定。

525加样回收试验取已知含量的1号云南重楼野生品粉末6份，每份约025 g，置具塞锥形瓶中，精密加入各对照品溶液（重楼皂苷Ⅶ 6126 mg·L-1、重楼皂苷D 2955 mg·L-1、重楼皂苷H 5700 mg·L-1、重楼皂苷Ⅵ 4204 mg·L-1、重楼皂苷Ⅱ 6447 mg·L-1、薯蓣皂苷2568 mg·L-1、纤细薯蓣皂苷5205 mg·L-1、重楼皂苷Ⅰ 4575 mg·L-1和重楼皂苷Ⅴ 5155 mg·L-1）各1 mL，分别按照22项方法制备供试品溶液，按3项下色谱方法测定，记录峰面积，计算回收率结果重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ平均加样回收率（n=6）分别为9915%，9732%，9865%，1012%，9836%，9731%，9818%，1005%，1024%，RSD分别为13%，15%，11%，22%，13%，19%，14%，13%，24%。

526样品含量测定分别取不同产地云南重楼药材，按22项方法制备供试品溶液，再按3项色谱条件进行测定，用外标法计算样品含量。结果见表2，3。

6讨论

61色谱条件的选择

本文采用梯度洗脱法分离云南重楼药材栽培品中的9种主要甾体皂苷成分，80 min内完成分离，重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ分离效果良好，符合含量测定要求。本文通过二极管阵列检测器考察所测物质紫外吸收，9种成分均为末端吸收，故选择203 nm作为检测波长。流动相比较了乙腈水和乙腈005%磷酸系统，乙腈水梯度洗脱各色谱峰均实现基线分离，能够达到定量要求。

62提取条件的优化

本实验对不同提取方式（加热回流和超声）、提取溶剂（50%，70%甲醇和甲醇）及提取时间（30，45，60 min）和取样量（02，05，10 g）进行考察，最终确定，称取药材粉末05 g，加甲醇25 mL加热回流提取30 min为最佳提取条件。

63含量测定结果分析

野生品和栽培品中重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ 9种甾体皂苷类成分含量差异较大，野生品和栽培品中组内9种成分的含量也相差较大。从样品测定总体结果来看，这9种成分中重楼皂苷D、重楼皂苷Ⅵ、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅴ在野生品和栽培品中含量均较低；野生品中重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H的平均含量高于栽培品；重楼皂苷I的平均含量低于栽培品；4种偏诺皂苷平均含量总和显著高于栽培品；5种薯蓣皂苷平均含量总和显著低于栽培品；栽培品种9种甾体皂苷平均含量高于野生品。偏诺皂苷和薯蓣皂苷具有相反的药理活性，薯蓣皂苷具有活血作用，偏诺皂苷具有止血作用[1314]，云南重楼栽培品可能更适合用于活血作用。

本研究建立云南重楼野生品和栽培品的特征图谱，并同时测定9种甾体皂苷成分，并进行了比较分析，为云南重楼药材质量综合评价提供了科学依据。云南重楼栽培品和野生品化学成分具有一定的差异，使用中应通过更多药理和临床试验进一步研究。

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