西藏藏族人群脂代谢相关基因多态性与血浆三酰甘油水平的关系研究

李 奎，格桑嘎瓦，平措扎西，卓玛次仁，古桑拉姆，仁 丹，达娃次仁，格桑罗布，华 桑，王 威，汪 建

·论著·

西藏藏族人群脂代谢相关基因多态性与血浆三酰甘油水平的关系研究

李 奎1，格桑嘎瓦1，平措扎西2，卓玛次仁1，古桑拉姆1，仁 丹1，达娃次仁1，格桑罗布1，华 桑3，王 威3，汪 建3

目的 探究西藏藏族人群血脂相关基因多态性(SNP)与血浆三酰甘油(TG)水平的关系。方法 2008年6—8月，采用随机整群抽样法抽取西藏那曲地区安多县扎仁镇(海拔4 800 m)、日喀则地区定日县扎西宗乡(海拔4 300 m)、山南地区琼结县雪巴乡(海拔3 740 m)、拉萨市城关区蔡公堂乡(海拔3 649 m)和林芝地区林芝县布久乡(海拔3 000 m)共5个不同海拔的乡镇，按照户籍信息纳入2 348藏族居民，其中1 085例采集到血液样本。采用美国西昆诺姆公司MassARRAY实验平台检测脂代谢相关基因SNP。结果 共选出10个脂代谢相关基因位点，包括rs964184、rs12678919、rs1260326、rs2954029、rs714052、rs7557067、rs17216525、rs10889353、rs854560、rs505151，除rs854560位点基因分型失败外，rs964184、rs12678919、rs1260326、rs2954029、rs714052、rs7557067、rs17216525、rs10889353及rs505151位点基因型分布均符合哈迪-温伯格遗传平衡。rs12678919、rs1260326、rs2954029、rs7557067、rs17216525、rs10889353及rs505151位点不同基因型藏族居民血浆TG水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。rs964184位点GC和GG基因型藏族居民血浆TG水平高于CC基因型藏族居民，GG基因型藏族居民血浆TG水平高于GC基因型藏族居民(P<0.05)；rs714052位点TC和TT基因型藏族居民血浆TG水平高于CC基因型藏族居民，TT基因型藏族居民血浆TG水平高于TC基因型藏族居民(P<0.05)。调整年龄、体质指数后，rs964184位点GC和GG基因型藏族居民血浆TG水平高于CC基因型藏族居民，GG基因型藏族居民血浆TG水平高于GC基因型藏族居民(P<0.05)；rs714052位点TC、TT基因型藏族居民血浆TG水平高于CC基因型藏族居民，TT基因型藏族居民血浆TG水平高于TC基因型藏族居民(P<0.05)。结论 西藏藏族人群脂代谢相关基因rs964184、rs714052位点SNP与血浆TG水平有关。

多态性，单核苷酸；血脂；藏族；三酰甘油

李奎，格桑嘎瓦，平措扎西，等.西藏藏族人群脂代谢相关基因多态性与血浆三酰甘油水平的关系研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2017，25(6)：32-37.[www.syxnf.net]

LI K，GESANG G W，PINGCUO Z X，et al.Relationship between lipid metabolism related gene polymorphism and plasma TG level in Zang population in Tibet[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2017，25(6)：32-37.

人群血脂指标的遗传变异主要受脂代谢相关基因结构和/或功能变异影响，脂代谢相关基因结构变异可导致基因功能变异，进而影响血脂指标合成和代谢，造成血脂指标遗传变异。近年研究发现，多个种族和/或地区人群脂代谢相关基因多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与血脂指标异常有关[1]，但有关我国人群特别是西藏藏族人群脂代谢相关基因SNP与血脂指标关系的大样本量研究报道较少。由于西藏地区具有相对封闭、交通不便、人员流动较小、人群遗传背景相对简单、生活习惯特点突出等，因此以西藏藏族人群作为研究对象具有得天独厚的研究资源优势及学术研究价值。本研究在全基因组关联分析(GWAS)研究基础上分析了西藏藏族人群脂代谢相关基因SNP与血浆三酰甘油(TG)水平的关系，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 纳入与排除标准 纳入标准：(1)年龄18～65岁；(2)户籍所在地属藏族地区；(3)民族为藏族且3代以内未与其他民族通婚。排除标准：(1)孕妇；(2)合并肿瘤等恶性疾病者。

1.2 研究对象 2008年6—8月，采取随机整群抽样法抽取西藏那曲地区安多县扎仁镇(海拔4 800 m)、日喀则地区定日县扎西宗乡(海拔4 300 m)、山南地区琼结县雪巴乡(海拔3 740 m)、拉萨市城关区蔡公堂乡(海拔3 649 m)和林芝地区林芝县布久乡(海拔3 000 m)5个不同海拔的乡镇，按照乡镇户籍信息纳入2 348例藏族居民，其中1 085例藏族居民采集到血液标本，血液标本采集失败的主要原因为外出打工和拒绝抽血。1 085例藏族居民中男413例，女672例。

1.3 检测方法 抽取所有藏族居民清晨空腹静脉血10 ml，分2管保存，每管5 ml。1管血液标本在采集后立即离心，离心率为2 000×g，离心时间为10 min，之后采用移液器吸取上层橙黄色血浆并置于0～4 ℃环境下保存待测；采用日本日立7060全自动生化分析仪及配套试剂盒检测血浆TG水平，检测工作由西藏自治区人民医院检验科专业技师完成。1管血液标本置于含乙二胺四乙酸(EDTA)真空抗凝管中，用于DNA提取。本研究血液样本由西藏自治区人民医院、西藏自治区疾控中心和深圳华大基因研究院在西藏地区不同乡镇同步开展健康体检时获得。

1.4 DNA提取方法 采用常规盐析法提取DNA，具体如下：取抗凝血500 μl，加入细胞裂解液(包括10 mmol/L Tris盐酸，10 mmol/L氯化钾，10 mmol/L氯化镁，2 mmol/L EDTA和2.5% Triton X-100)1 ml混匀，6 000 r/min离心5 min，重复裂解1次，加入细胞裂解液(包括10 mmol/L Tris盐酸，10 mmol/L氯化钾，10 mmol/L氯化镁，2 mmol/L EDTA和1% SDS)150 μl混匀，56 ℃恒温箱孵育15 min；加饱和氯化钠150 μl混匀，10 000 r/min离心5 min；小心吸取水相，加2倍体积无水乙醇轻轻混匀，12 000 r/min离心5 min，弃上清液，待干，加入无菌双蒸水50 μl溶解DNA。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳确定DNA质量，以DNA有明显基因组DNA条带且无明显拖尾为合格。本研究所有血液样本DNA提取成功。

1.5 脂代谢相关基因位点 结合文献报道并参考近期大样本量GWAS研究结果共选出10个脂代谢相关基因位点，详见表1。

1.6 SNP检测方法

1.6.1 主要试剂和仪器 (1)主要试剂：iPLEX反应试剂、384-well SpectroCHIP生物芯片、HOTSTART Taq酶、SAP酶、纯化琼脂等。(2)主要仪器：质谱检测仪(MassARRAY Analyzer Compact)、点样仪(MassARRAY Samsung Nanodispenser)、384孔双头PCR仪(GeneAmp®PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module)。

1.6.2 检测步骤 (1)设计并合成引物：采用美国西昆诺姆公司ASSAY-DESINE软件设计引物，由Invitrogen公司合成引物；(2)实验操作：参照SEUENOM公司标准Protocol操作，采用美国西昆诺姆公司MassARRAY实验平台检测脂代谢相关基因SNP，脂代谢相关基因位点引物序列详见表2。

表1 脂代谢相关基因位点

注：“-”表示不详或未提及

2 结果

2.1 基因分型 除rs854560位点基因分型失败外，rs964184、rs12678919、rs1260326、rs2954029、rs714052、rs7557067、rs17216525、rs10889353及rs505151位点基因型分布均符合哈迪-温伯格遗传平衡，见表3。

表2 脂代谢相关基因位点引物序列

表3 西藏藏族居民9个脂代谢相关基因位点基因分型

Table 3 Genotypes of 9 lipid metabolism related genetic locus in Tibetan residents

基因位点单体型单体型对应基因型例数O(HET)E(HET)P值rs964184GC30/275/7800 25460 25560 905rs12678919GA6/123/9560 11340 11670 300rs1260326TC212/536/3370 49450 49320 951rs2954029TA276/531/2780 49350 49990 670rs714052CT79/400/6060 37420 3710 869rs7557067AG85/416/5840 38380 39360 397rs17216525TC12/172/9010 15850 16430 264rs10889353CA59/379/6470 34930 35320 731rs505151GA23/87/9750 08170 08350 448

2.2 不同基因型脂代谢相关基因藏族居民血浆TG水平比较 rs12678919、rs1260326、rs2954029、rs7557067、rs17216525、rs10889353及rs505151位点不同基因型藏族居民血浆TG水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。rs964184和rs714052位点不同基因型藏族居民血浆TG水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；rs964184位点GC和GG基因型藏族居民血浆TG水平高于CC基因型藏族居民，GG基因型藏族居民血浆TG水平高于GC基因型藏族居民，差异有统计学意义(P<0.05)；rs714052位点TC、TT基因型藏族居民血浆TG水平高于CC基因型藏族居民，TT基因型藏族居民血浆TG水平高于TC基因型藏族居民，差异有统计学意义(P<0.05，见表4、图1)。调整年龄、体质指数后，rs964184和rs714052位点不同基因型藏族居民血浆TG水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；rs964184位点GC和GG基因型藏族居民血浆TG水平高于CC基因型藏族居民，GG基因型藏族居民血浆TG水平高于GC基因型藏族居民，差异有统计学意义(P<0.05)；rs714052位点TC、TT基因型藏族居民血浆TG水平高于CC基因型藏族居民，TT基因型藏族居民血浆TG水平高于TC基因型藏族居民，差异有统计学意义(P<0.05，见表5)。

Table 5 Comparison of plasma TG level in Tibetan residents with different genotypes of rs964184 and rs714052 after correction of age and BMI

基因型例数TGF值P值rs964184位点15 428<0 001CC7801 12±0 00GC2751 32±0 03aGG301 41±0 12abrs714052位点4 3320 013CC791 03±0 07TC4001 14±0 03cTT6061 21±0 02cd

注：与rs964184位点CC基因型比较，aP<0.05；与rs964184位点GC基因型比较，bP<0.05；与rs714052位点CC基因型比较，cP<0.05；与rs714052位点TC基因型比较，dP<0.05

表4 不同基因型脂代谢相关基因藏族居民血浆TG水平比较

注：TG=三酰甘油；与rs964184位点CC基因型比较，aP<0.05；与rs964184位点GC基因型比较，bP<0.05；与rs714052位点CC基因型比较，cP<0.05；与rs714052位点TC基因型比较，dP<0.05

图1 rs964184、rs714052位点基因型与藏族居民血浆TG水平关系的示意图

Figure 1 Schematic plot for relationship between genotypes of rs964184，of rs714052 and plasma serum TG levels in Tibetan residents

2.3 西藏藏族居民脂代谢相关基因SNP阳性位点特点分析 西藏藏族居民rs964184、rs714052位点基因型分布与欧洲人、中国人不完全一致，见表6。

表6 既往文献中脂代谢相关基因SNP位点基因型

Table 6 Genetic locus genotypes of lipid metabolism related gene polymorphism in the history literatures

SNP位点主要单体型次要单体型HapMap(欧洲人)HapMap(中国人)HapMap(GWAS结果)HapMap(本研究结果)rs964184CG0 1080 2440 1400 130rs714052AG0 1170 0980 1200 210

注：HapMap=人类基因组单体型图；GWAS=全基因组关联分析

3 讨论

rs964184位点位于11号染色体长臂，与APOA1-APOC3-APOA4-APOA5基因簇较为接近，距离约为11.2 kb。APOA1-APOC3-APOA4-APOA5基因簇是较早被发现的与血脂指标相关的基因簇，于2001年被鉴定[6-8]，但其影响血脂指标的具体机制尚不明确。有研究表明，APOA1-APOC3-APOA4-APOA5基因簇中多个基因位点SNP可能与高三酰甘油血症有关[9-10]。本研究结果显示，rs964184位点C基因型为保护性因素，可导致血浆TG水平下降，与GWAS结果较为一致。由于rs964184位点位于APOA1-APOC3-APOA4-APOA5基因簇下游较远处，因此其直接调节基因表达的可能性较小，很可能仅作为一个遗传标记或与APOA1-APOC3-APOA4-APOA5基因簇的某些特殊改变连锁。

rs714052位点位于7号染色体长臂BAZ1B基因内含子中，而BAZ1B基因编码的蛋白质属bromodomain蛋白家族[11]。BAZ1B基因与基因转录、调控、细胞周期等密切相关，但目前该基因与血浆TG水平关系的研究报道较少。与rs714052位点相邻的基因还有MLXIPL基因，MLXIPL基因编码的蛋白质属转录因子，且该转录因子以葡萄糖依赖方式作用于TG合成相关基因启动子区域，可能在糖类和脂类代谢过程中发挥着重要作用。一项大规模研究结果显示，MLXIPL基因rs3812316位点与血浆TG水平高度相关，且其他3个与rs3812316相邻的基因位点亦与血浆TG水平相关，rs3812316及其相邻的3个基因位点共跨越约200 kb的距离，存在高度连锁不平衡[12]；脂代谢相关基因rs714052位点恰好位于这个连锁不平衡片段内，因此rs714052位点可能通过影响MLXIPL基因表达而影响血浆TG水平，但其也可能与rs964184位点一样，仅作为一个遗传标记或与MLXIPL基因中的某些特殊改变连锁。

本研究在GWAS基础上发现西藏藏族人群脂代谢相关基因rs964184和rs714052位点SNP与血浆TG水平相关，但以上两个基因位点均位于不会引起蛋白质变化或直接参与调节基因表达区域，故可能仅作为一个遗传标记。此外，本研究结果还提示APOA1-APOC3-APOA4-APOA5基因簇和MLXIPL基因可能与西藏藏族人群血脂指标有关，但限于时间和经费原因未能进一步研究，有待在今后研究中对以上两个基因簇或基因片段进行测序，以探讨西藏藏族人群脂代谢相关基因的特殊变异。

本研究通过分析西藏藏族居民脂代谢相关基因SNP阳性位点特点发现，与西藏藏族人群血浆TG水平相关基因位点rs964184和rs714052基因型分布与欧洲人、中国人不完全一致，这可能与西藏藏族人群遗传背景特点有关；此外，本研究采用的MassARRAY实验平台中的MALDI-TOF-MS基因分型技术虽然具有准确率高、灵敏度高、成本低等优点，但其位点覆盖度相对不全，而由于MALDI-TOF-MS基因分型技术主要参照的是白种人、不同种族基因分型不同，因此在本研究结果可能存在一定的种群差异及选择偏倚。

综上所述，西藏藏族人群脂代谢相关基因rs964184、rs714052位点SNP与血浆TG水平有关。

作者贡献：李奎、平措扎西、王威参与实验设计及实施，李奎、格桑嘎瓦、平措扎西、卓玛次仁、古桑拉姆、仁丹、达娃次仁、格桑罗布、华桑、王威、汪建进行资料收集及整理，李奎、格桑嘎瓦、平措扎西进行论文撰写。

本文无利益冲突，作者署名及顺序无争议。

致谢：由于西藏农牧地区地广人稀、交通不便、高寒缺氧等，因此在本研究过程中遇到诸多困难，在此特别感谢西藏自治区人民医院、西藏自治区疾控中心和深圳华大基因研究院积极协助和支持本研究的所有工作人员。

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(本文编辑：谢武英)

Relationship between Lipid Metabolism Related Gene Polymorphism and Plasma TG Level in Zang Population in Tibet

LIKui1，GESANGGa-wa1，PINGCUOZha-xi2，ZHUOMACi-ren1，GUSANGLa-mu1，RENDan1，DAWACi-ren1，GESANGLuo-bu1，HUASang3，WANGWei3，WANGJian3

1.ThePeople′sHospitaloftheTibetAutonomousRegion，Lhasa850000，China2.DiseaseControlandPreventionCenterofTibetAutonomousRegion，Lhasa850000，China3.ShenzhenHuadaGeneResearchInstitute，Shenzhen518083，ChinaCorrespondingauthor：GESANGGa-wa，E-mail：2218473811@qq.com

Objective To study the relationship between lipid metabolism related gene polymorphism and plasma TG level in Zang population in Tibet.Methods From June to August in 2008 in Tibet，a total of 5 towns locating with different altitude were selected by random cluster sampling method，including Zharen Town of Amdo County of Nagqu Prefecture(altitude：4800 m)，Tashi Town of Tingri County of Shigatse Prefecture(altitude：4 300 m)，Sherpa Town of Qonggyai County of Lhoka Prefecture(altitude：3 740 m)，Choi Court Town of Chengguan District of Chengguan District(altitude：3 649 m)and Puqu Town of Nyingchi County of Nyingchi Prefecture(altitude：3 000 m)，and then 2 348 Tibetan residents were enrolled according to household registration information，thereinto 1 085 Tibetan residents′ blood samples were collected.MassARRAY experiment platform(Sequenom，Inc)was used to detect the lipid metabolism related gene polymorphism.Results A total of 11 lipid metabolism related genetic locus were found，including rs964184，rs12678919，rs1260326，rs2954029，rs714052，rs7557067，rs17216525，rs10889353，rs854560，rs505151，genotype distribution of above lipid metabolism related genetic locus was in accord with Hardy-Weinberg genetic equilibrium，respectivelly，excepted for rs854560.No statistically significant differences of plasma TG level was found in Tibetan residents with different genotypes of rs12678919，rs1260326，rs2954029，rs7557067，rs17216525，rs10889353 or rs505151(P>0.05).Plasma TG level of Tibetan residents with GC or GG genotype of rs964184 was statistically significantly higher than that of Tibetan residents with CC genotype of rs964184，respectively，meanwhile plasma TG level of Tibetan residents with GG genotype of rs964184 was statistically significantly higher than that of Tibetan residents with GC genotype of rs964184(P<0.05).Plasma TG level of Tibetan residents with TC or TT genotype of rs714052 was statistically significantly higher than that of Tibetan residents with CC genotype of rs714052，respectively，meanwhile plasma TG level of Tibetan residents with TT genotype of rs714052 was statistically significantly higher than that of Tibetan residents with TC genotype of rs714052(P<0.05).After correction of age and BMI，plasma TG level of Tibetan residents with GC or GG genotype of rs964184 was statistically significantly higher than that of Tibetan residents with CC genotype of rs964184，respectively，meanwhile plasma TG level of Tibetan residents with GG genotype of rs964184 was statistically significantly higher than that of Tibetan residents with GC genotype of rs964184(P<0.05)；plasma TG level of Tibetan residents with TC or TT genotype of rs714052 was statistically significantly higher than that of Tibetan residents with CC genotype of rs714052，respectively，meanwhile plasma TG level of Tibetan residents with TT genotype of rs714052 was statistically significantly higher than that of Tibetan residents with TC genotype of rs714052(P<0.05).Conclusion Lipid metabolism related gene polymorphism(including rs964184 and rs714052) is significantly correlated with plasma TG level in Zang population in Tibet.

Polymorphism，single nucleotide；Blood lipid；Zang Nationality；Triacylglycerol

国家科技支撑计划项目(2013BAI05B04)；西藏自治区科技厅课题(2007-18)

格桑嘎瓦，E-mail：2218473811@qq.com

R 394.5

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.06.008

2017-02-15；

2017-05-20)

1.850000西藏拉萨市，西藏自治区人民医院

2.850000西藏拉萨市，西藏自治区疾控中心

3.518083 广东省深圳市，深圳华大基因研究院