泛素结合结构域在泛素化底物鉴定中的应用*

王京伟综述 武军驻审校

泛素结合结构域在泛素化底物鉴定中的应用*

王京伟1综述 武军驻2审校

泛素化(Ubiquitylation)是目前真核细胞内已知的最复杂的翻译后修饰。泛素化底物的识别需要一类特异性受体蛋白介导，这些受体蛋白往往包含一个或多个泛素结合结构域(UBDs)。UBD-泛素间的特异性结合决定了泛素化底物功能的特异性。目前已发现20多种UBDs超家族可识别泛素化底物上的特异性功能团进而传递信号。因此深入了解UBD的识别机制对新UBD的发现及泛素化底物的鉴定具有重要意义。

泛素；泛素结合结构域；泛素化蛋白质组学

泛素化(Ubiquitylation)是泛素分子以泛素单体或泛素链的形式共价修饰细胞内其它翻译后的蛋白质。泛素化修饰可利用泛素本身所包含的7个赖氨酸位点(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)和位于N端的甲硫氨酸(Met1)位点，发生自泛素化进而延伸成不同类型的多聚泛素链，如最常见的K48和K63位多聚泛素链。已有学者先后利用高精度质谱技术在酿酒酵母体内检测到8种同质性的多聚泛素链类型[1，2]，并发现不同类型泛素链的丰度存在较大差异。此外，单泛素化、多位点单泛素化、杂合异质型泛素链、分枝状多聚泛素链以及游离多聚泛素链等多种泛素化修饰形式陆续被发现，多元化的泛素化修饰方式从侧面反映了真核细胞中蛋白质泛素化修饰的普遍性、结构的多样性、调控的复杂性及功能的重要性。

不同蛋白质底物、同一底物的不同氨基酸修饰位点及同一位点上的不同泛素链类型均可导致细胞效应的差异。泛素化修饰可改变靶蛋白的亚细胞定位、影响其蛋白活性，进而调控细胞内蛋白酶体降解途径、囊泡运输、信号转导、DNA修复、转录调节、细胞周期调控、抗原提呈、凋亡、自噬以及细胞分化等生物学过程。蛋白质的泛素化修饰可影响甚至决定底物蛋白的命运，泛素化及其信号转导的改变或失衡可引发包括癌症、神经退行性疾病在内的多种严重且难以治愈的人类疾病。因此深入研究泛素及其修饰系统，鉴定泛素化底物蛋白，了解其调控机制对相关疾病分子机制的理解和治疗具有重要意义。

1 泛素结合结构域(Ubiquitin Binding Domains，UBDs)

1.1 UBDs概述

UBDs与泛素、类泛素蛋白质(包括它们的结合、去结合状态)、底物蛋白、泛素化酶以及蛋白酶体所构成的系统总称为泛素化网络。泛素化网络的调节取决于一类可以特异性识别不同长度及不同修饰类型泛素链或泛素单体的受体蛋白家族，即泛素结合蛋白(Ubiquitin Binding Proteins，UBPs)，每个UBP往往包含一个或多个UBDs[3，4]。UBD可识别并结合不同类型的泛素化修饰并传递信号，进而决定底物蛋白功能的特异性。因此UBDs在泛素化信号网络中有着举足轻重的作用。UBDs分子量较小，多在20-150个氨基酸之间，可独立折叠形成稳定结构以非共价键的形式直接结合单泛素化或聚泛素化底物。

1.2 UBDs的分类

目前已发现的UBDs有20多种，根据其空间构象特点将其分为5种类型。

1.2.1 α螺旋结构(α-Helix)结构域：α-Helix结构域包含已知的UIMs、UBAs、泛素相互作用基序相反的结构域(Motif Interacting with Ubiquitin or Inverted UIM，MIU/IMIU)、UMI和MIU相关泛素结合结构域(UIM-and MIU-related UBD，UMI)、双面UIM (Double-sided UIM，DUIM)、泛素结合基序(Ubiquitin-binding Motif，UBM)、UBAN、CUE结构域、定位于高尔基体的含γ 衔接蛋白耳的ADP核糖基化因子结合蛋白和Myb的靶标TOM上的结构域[GGA (Golgi-localized，Gamma-ear-containing，ADP-ribosylation-factor-binding Protein) and TOM(target of Myb)，GAT]、液泡分选蛋白Vps27、HRS、STAM上的结构域[Vacuolar Sorting Protein) 27/Hrs/STAM，VHS] 、UIM类似结构域等；其中最普遍的是UIM和UBA结构域。

UIM结构域是第一个被发现的UBDs，是一段大约20个氨基酸残基的肽段，存在于蛋白酶体亚基S5a/RPN10蛋白中。根据S5a内 UBDs的氨基酸序列，采用隐马尔可夫模型以及迭代数据库搜索的方法在其它蛋白中找到了类似的序列，将其统称为UIM结构域。核磁共振光谱(NMR)技术显示UIM结构域的空间构象是一段短的螺旋，该构象可以很好的将所有的保守残基暴露于表面。

UBA结构域是第一个通过生物信息学技术发现并广泛存在于泛素修饰相关酶内UBDs。几乎与UIMs同时期被发现。UBA结构域是一段由约45个保守氨基酸残基组成的短肽，可以识别单泛素化或聚泛素链修饰的底物蛋白，液态结构解析发现某些UBP保守疏水区域内存在两个UBA，两个UBA与其linker区域一起形成3个串联的螺旋束结构，大大增强UBA结构域与底物的结合能力。根据识别泛素链的类型以及能力可以将UBA家族分为四类：第一类：选择性识别K48位多聚泛素链的UBA家族，如hR23A-UBA2；第二类：偏好于K63-Ub4的UBA家族，如泛素结合酶E2-25K-UBA及蛋白Drm2上的两个 UBAs；第三类：不识别任何类型泛素链的UBA家族(占已发现的UBA家族的30%)，如 isoT-UBA1 和c-Cbl-UBA；第四类：与多种泛素链类型有等效结合力的UBA家族，如isoT-UBA2，Cbl-b-UBA 和UQ1-UBA。

近来研究还发现，UBA 和UIM可保护泛素化底物蛋白不被降解[5]，然而这种保护的机制以及发挥保护作用的生物空间还不甚明了。

1.2.2 锌指结构(Zinc Finger，ZnF)：ZnF包含泛素结合锌指(Ubiquitin-binding Zinc Finger，UBZ)、Npl4锌指(Npl4 Zinc Finger，NZF)、泛素特异性加工蛋白酶锌指(Ubiquitin-specific processing Protease ZnF，ZnF UBP)、A20锌指(A20 ZnF)、多聚泛素相关锌指结构域(Polyubiquitin-associated Zinc Binding，PAZ)等。根据其泛素分子表面的识别热点可将其分为2类。一类ZnF以螺旋结构识别泛素β折叠上Ile44疏水补丁，空间排列上与泛素分子的β折叠呈平行或反平行[6]。另一类ZnF家族成员识别泛素分子C末端的氨基酸残基，其广泛存在于异肽酶T (Isopeptidase，IsoT)中。ISoT的这一独特性识别位点使其能特异性地识别并催化泛素化底物释放游离泛素链，并可与其它识别Ile44疏水中心的UBDs成员一起协同识别并作用于泛素化底物。

1.2.3 泛素结合酶类似结构域(Ubiquitin-conjugating，Ubc-like Domain)：Ubc-like Domain包括泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating Enzyme，Ubc)、泛素结合酶E2变体(Ubiquitin-conjugating Enzyme E2 Variant，UEV)结构域等；Ubc-like Domain往往以β折叠的构象存在，参与单泛素化蛋白的识别。

部分Ubc-like Domain只有识别泛素链中泛素单体间的linker区域，充分暴露水解位点才能完成对泛素链的水解，该类结构域主要存在于去泛素化酶(Deubiquitinating Enzymes，DUB)内。不同DUBs家族内UBDs对不同泛素链类型有很高的特异性[7，8]。

还有一部分Ubc-like domain可同时识别底物蛋白及其修饰的泛素(链)，虽然这两种结合方式都比较弱，但两者协同作用不但增加了结合能力也提高了结合的特异性[9]。

1.2.4 普列克底物蛋白同源结构域(Pleckstrin Homology Domain，PH Domain)：PH Domain包括GRAM样泛素蛋白结合结构域(GRAM-like Ubiquitin-binding in Eap45，GLUE)、普列克底物蛋白同源结构域(Plekstrin Homology for Ubiquitin，PRU)等；内体蛋白分选转运装置亚基Vps36上同时存在GLUE结构域和一个断裂的普列克底物蛋白同源结构域(Split Pleckstrin Homology Domain，SPH)，SPH结构域利用其β折叠(S5 和S6)上的残基识别泛素分子的疏水区，协同GLUE结构域上的loop及 -Helix共同参与底物的识别。与GLUE的识别方式不同，蛋白酶体非ATP酶调节亚基13(RPN13)的PRU结构域以3个loops识别表面特异性结合泛素β折叠，同时与泛素分子的His68形成氢键，PRU的这些特性使其对单泛素化底物也有较高的亲和力。

1.2.5 其它类型：其它类型UBDs如SRC同源3结构域 (SRC Homology 3 Domain，SH3)、PLAA家族泛素结合结构域(PLAA Family Ubiquitin Binding，PFU)、Mpr1-Pad1氨基末端(MPN)结构域[Mpr1p Pad1p N-terminal (MPN) domain，MPN]、卵巢癌结构域(Ovarian Tumor Domains，OTU)等。与大多数UBDS家族成员类似，SH3结构域也可以识别Ile44疏水中心。不同结构的UBDs家族成员识别同一位点却传递不同的泛素化信号，说明UBDs的特异性识别决定着泛素化信号的命运。此外，相同结构的UBDs对泛素链的识别也存在偏好型的差异，含有OTU结构域的DUB蛋白具有较好的泛素链特异性。如A20的OUT结构域只对K48位多聚泛素链有水解作用，而TRABID蛋白的OTU结构域则偏好水解K63位多聚泛素链[7]。

不同类型的UBDs对泛素分子表面的识别热点、泛素链的偏好、泛素底物的亲和力及相互作用方式等都存在一定的差异[10]。有研究发现疏水作用在UBDs与K6，K11，K33和K48位双泛素化修饰(dimeric Ub chains ，diUbs)底物结合的拓扑结构中起主导作用，而静电作用则在UBDs与 K27-，K29-，K63-和线性泛素链修饰底物结合的拓扑结构中发挥更加重要的作用[11]。

2 泛素化底物鉴定的意义

蛋白质泛素化修饰在细胞生命活动的方方面面均起着重要的作用[12-14]，泛素化修饰对细胞的生命活动至关重要。这些过程的失调可引发如帕金森病、亨廷顿症、阿尔茨海默症、以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症等多种严重的人类疾病。尽管泛素发现已有半个多世纪，与泛素相关的研究成果也层出不穷，但是由于泛素化系统的复杂性，目前人们的认知只是冰山一角，很多问题仍有待研究，如泛素修饰酶的底物鉴定、细胞平衡打破后蛋白质泛素化修饰的改变等，这些问题的研究均有赖于泛素化底物的鉴定及泛素化位点的识别。

目前高精度串联质谱是实现大规模泛素化底物鉴定及泛素化位点识别的主流手段[15]，已广泛应用于蛋白质翻译后修饰的研究中。泛素化底物的丰度，底物间的相互作用，底物上的其它翻译后修饰，底物的亚细胞定位及底物的合成和降解等信息均可从高精度串联质谱的数据中得出，了解底物蛋白的这些生物学特性，对认识底物相关疾病的发病原理，寻找潜在治疗靶点有重要意义。

3 UBDs在泛素化底物识别中的作用

3.1 泛素化底物鉴定的基础及其挑战

泛素分子量约为8 500Da，因此一旦底物蛋白被泛素化修饰便会形成明显的分子量跃迁，修饰的泛素单元越多，分子量的跃迁就越大。在胰蛋白酶(Trypsin)作用下，泛素化底物上的泛素化位点Lys由于泛素化产生一个带2个甘氨酸标签的分枝状漏切肽段，这2个甘氨酸标签是由于修饰的泛素分子的C末端通过异肽键与泛素化位点的Lys结合，经过Trypsin消化后保留的残基。产生的信号肽在质谱信号中会产生一个114.043Da的质量跃迁，结合漏切的Lys位点，合称为GG-K信号肽[16](图1)，通过该信号肽结合数据库搜索引擎可实现对泛素化底物的鉴定。这也是高精度质谱技术实现泛素化底物鉴定的基础。

图1 质谱鉴定泛素化蛋白的方案[16]

然而，泛素化组学的鉴定因缺乏有效的富集手段而面临着很大的挑战，主要来自以下几个方面：(1)某一特定蛋白只在某一特定条件下发生泛素化；(2)DUB随时可以将泛素化逆转，只需要几毫秒的时间；(3)聚泛素链的存在使泛素本身成为最丰富的泛素化底物，干扰其它低丰度底物的离子信号(泛素化蛋白质样品中游离泛素的高丰度屏蔽了底物蛋白的信号)；(4)泛素化蛋白丰度低对，泛素蛋白质组学进行质谱检测时，其低丰度泛素信号被高丰度阴性肽段信号干扰，降低了质谱鉴定的效率；(5)非典型泛素链(Atypical Chains)，包括K6、K27、K29、K33、分枝状、异质型等泛素链，由于丰度较低，缺乏合成相应泛素链的特异性酶的存在，很难被质谱技术鉴定到；(6)缺乏对质谱鉴定的假阳性结果的合理排除方案。

3.2 泛素化底物的纯化及鉴定手段

目前多采用亲和纯化联合高精度质谱的方法对泛素化底物及泛素化位点进行鉴定。常用的技术为用标签(如FLAG、HA-tag、myc-tag、His-tag、和biotin)标记泛素，先纯化标签标记的泛素再进行质谱鉴定。Peng等[17]在变性条件下成功地从酿酒酵母中富集出His-tag标记的泛素化蛋白，经过质谱鉴定，共发现了110个泛素化蛋白。该方法也被应用于其它泛素化底物的鉴定[18]和内质网相关降解途径特异性底物的筛查[19]。Tagwerker等[20]尝试将His-tag与biotin串联标记泛素以期增加纯化泛素化蛋白的精确度以及纯度，在变性条件下共鉴定出258个泛素化蛋白，发现40多个新的蛋白酶体结合蛋白。

近年来随着泛素化抗体的不断发现提高了对泛素化蛋白鉴定的成果，目前已知的泛素化抗体有K11位多聚泛素链抗体[21]、K63位多聚泛素链抗体及泛素GG肽抗体[22，23]等，新的泛素链特异性抗体还在不断被发现，这对我们了解链特异性泛素化的生物学功能有重要意义。

此外，泛素化位点的计算机预测网络也是目前泛素化底物及泛素化位点鉴定极具潜力的策略，许多生物信息学的方法和工具被开发用于预测泛素化网络。但是，这些工具往往具有不同的方法学、算法、功能和特征，使得其对泛素化位点预测效能及应用变得复杂。因此在选择网络服务器和独立软件时应先对相应的泛素化基准数据集的效能进行评估。目前现有的基准数据库(Benchmark Datasets)有针对酿酒酵母(S.cerevisiae)、人(H.sapiens)、小鼠(M.musculus)、拟南芥(A.thaliana)泛素化网络的数据库，其可预测泛素化位点见表1[24，25]。

表1 泛素化数据库预测泛素化蛋白数量和位点数量

3.3 UBD在泛素化底物鉴定中的应用

近年来，串联UBD纯化技术的发展使泛素化底物蛋白鉴定工作有新的突破，借助UBDs对不同泛素化修饰类型的选择性，结合先进的质谱技术平台，是探索泛素化网络及其生物学功能强有力的工具。

2005年，Mayor等[26]就尝试将His-tag标记及串联UBD纯化相结合的方法来提高泛素化底物蛋白鉴定的特异性。现在，越来越多的科学家意识到UBDs作为泛素化底物的富集工具的优势，UBD纯化技术不断地得到了改良和优化。

UBA结构域做为一个相对无链偏好性的泛素识别结构域，能够识别多种泛素化修饰形式。Shi 等[27]利用4个串联UBA结构域做为工具来富集人体内的泛素化底物蛋白，并通过高精度串联质谱技术实现泛素化修饰位点的鉴定。随后Rubel 等[28]利用改良的4个串联UBA结构域进行泛素化蛋白的富集，得到小鼠体内Myc 标签标记MuRF1泛素连接酶(Ubiquitin Ligase，E3)的底物。该方法可以进一步扩展到研究泛素连接酶及DUBs底物鉴定。

近年来，我国学者系统地评估了多种UBD对不同类型泛素链的亲和力。通过选择具有高亲和力的UBD评估不同长度和类型的各种UBD组合，构建了高亲和力的串联UBD(ThUBD)。ThUBD表现出较天然UBD更高亲和力且无链偏好性。利用ThUBD分别从酵母和哺乳动物细胞中鉴定出1 092和7 487个潜在泛素化底物蛋白，其中362和1 125个蛋白质具有泛素修饰位点[29]。相较标签标记的泛素纯化手段，UBD泛素纯化工具的应用可避免过度表达标记的泛素，避免利用泛素抗体来清除游离泛素残基的必要，是泛素化蛋白质组研究较为容易获得的工具。通过构建某一链特异性UBD串联工具，将其用于泛素化底物蛋白谱的鉴定，了解该种泛素链的生物学功能和绘制“泛素链图谱”具有重要意义。目前Atypical Chains的功能及生物学意义已逐渐清晰[30]。此外，利用标签标记泛素化系统的特异性酶，如泛素激活酶(Ubiquitin-activating Enzyme，E1)、泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating Enzyme，E2)、泛素连接酶(E3)以及可以逆转泛素化修饰的DUBs，通过结合高亲和力且无链偏好性的UBDs纯化技术，理论上可以筛选出不同泛素化酶系统的底物蛋白，可使我们对泛素化网络的认识更全面。

同时，利用UBD纯化工具分析正常和疾病模型系统中的泛素化酶系统底物蛋白谱，实现在各种生物学条件下鉴定相关的泛素化酶的生理底物，将为深入了解泛素化网络在相关疾病中的作用机制提供重要的依据，进一步挖掘泛素化网络系统作为疾病治疗新靶标。

3.4 泛素化网络研究成果

大规模的泛素化底物的鉴定在酿酒酵母，哺乳细胞，植物细胞器官水平中已经有成功的尝试[31]，并取得了一定的成绩，最大的一次鉴定量达到了19，000个泛素化位点，8，000多个泛素化蛋白(见表2)。然而相对于磷酸化研究而言，泛素化蛋白质组的研究才刚刚起步[32]。相信随着泛素纯化工具的不断改良优化及质谱定量技术的不断发展，泛素化位点的鉴定必定会越来越容易。

表2 泛素化位点的鉴定成果

4 小结

泛素化信号网络异常与人类许多恶性肿瘤、神经退行性病变[42]、心血管疾病[43]、肝纤维化[44]、线粒体蛋白质量控制并介导线粒体自噬[45]及糖尿病等疾病的发生、发展有关，其在中药抗炎[46]、未来肿瘤治疗[47]中的作用将成为研究热点，UBDs极有可能成为临床新的药物治疗靶标之一[48]。组蛋白乙酰化酶6(Histone Deacetylase 6 Protein，HDAC6)结构域做为神经退行性疾病新的治疗靶点的可能性已经引起部分学者的关注[49]。敲除有丝分裂原激活蛋白3激酶1(Mitogen-activated Protein 3 Kinase 1，Map3k1)后会引起一系列的泛素蛋白谱变化，说明泛素化信号在MARK通路中发挥着某种从未发现的调节作用，决定着细胞走向凋亡或增殖的命运[50]。

但目前还没有发现可以特异性识别不同泛素链长度修饰底物的UBDs。因此发现新的UBDs成员对进一步深入挖掘UBD-泛素网络有重要意义。很多已知UBD的loop结构而非成熟的二级结构元件参与泛素的识别，提示三级结构中未被定义的蛋白模块有可能会是潜在的泛素结合元件，这将使发现新的UBDs成为可能。新的UBDs，将有助于从各个方面了解泛素化网络的构成和作用方式，尤其是泛素化网络中起到关键枢纽作用的蛋白，即泛素调节的关键节点蛋白，这些关键节点极有可能是未来药学和医疗应用的靶标[51]。

本文作者简介：

王京伟 (1986-)，女，汉族，博士，主治医师，主要从事分子诊断与个体化医疗研究及蛋白质组学研究

1 Xu P，Duong DM，Seyfried NT，et al. Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation[J]. Cell，2009，137(1)：133-145.

2 Komander D. The emerging complexity of protein ubiquitination[J]. Biochem Soc Trans，2009，37( 5)：937-953.

3 Hicke L，Schubert HL，Hill CP. Ubiquitin-binding domains[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6(8)：610-621.

4 Hurley JH，Lee S，Prag G. Ubiquitin-binding domains[J]. Biochem J，2006，399(3)：361-372.

5 Tyrrell A，Flick K，Kleiger G，et al. Physiologically relevant and portable tandem ubiquitin-binding domain stabilizes polyubiquitylated proteins[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(46)：19 796-19 801.

6 Alam SL，Sun J，Payne M，et al. Ubiquitin interactions of NZF zinc fingers[J]. EMBO J，2004，23(7)：1 411-1 421.

7 Komander D，Reyes-Turcu F，Licchesi JD，et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains[J]. EMBO Rep，2009，10(5)：466-473.

8 Lork M，Verhelst K，Beyaert R. CYLD，A20 and OTULIN deubiquitinases in NF-[kappa]B signaling and cell death：so similar，yet so different[J]. Cell Death Differ，2017，24(7)：1 172-1 183.

9 Sundquist WI，Schubert HL，Kelly BN，et al. Ubiquitin recognition by the human TSG101 protein[J]. Mol Cell，2004，13(6)：783-789.

10 王京伟. 泛素结合结构域与泛素化信号的识别[J]. 现代检验医学杂志，2015，(2)：99-104.

11 Wang Y，Tang C，Wang E，et al. Polyubiquitin chain linkage topology selects the functions from the underlying binding landscape[J]. PLoS Comput Biol，2014，10(7)：e1003691.

12 Hicke L. A new ticket for entry into budding vesicles-ubiquitin[J]. Cell，2001，106(5)：527-530.

13 Raiborg C，Rusten TE，Stenmark H. Protein sorting into multivesicular endosomes[J]. Current Opinion in Cell Biology，2003，15(4)：446-455.

14 Staub O，Rotin D. Role of ubiquitylation in cellular membrane transport[J]. Physiological Reviews，2006，86(2)：669-707.

15 Zhu B，Farris TR，Milligan SL，et al. Rapid identification of ubiquitination and SUMOylation target sites by microfluidic peptide array[J]. Biochemistry and Biophysics Reports，2016，5：430-438.

16 Marotti LA，Newitt R，Wang Y，et al. Direct identification of a G protein ubiquitination site by mass spectrometry[J]. Biochemistry，2002，41(16)：5 067-5 074.

17 Peng J，Schwartz D，Elias JE，et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination[J]. Nat Biotechnol，2003，21(8)：921-926.

18 Kirkpatrick DS，Denison C，Gygi SP. Weighing in on ubiquitin：the expanding role of mass-spectrometry-based proteomics[J]. Nat Cell Biol，2005，7(8)：750-757.

19 Hitchcock AL，Auld K，Gygi SP，et al. A subset of membrane-associated proteins is ubiquitinated in response to mutations in the endoplasmic reticulum degradation machinery[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，100(22)：12 735-12 740.

20 Tagwerker C，Flick K，Cui M，et al. A tandem affinity tag for two-step purification under fully denaturing conditions：application in ubiquitin profiling and protein complex identification combined with in vivocross-linking[J]. Mol Cell Proteomics，2006，5(4)：737-748.

21 Matsumoto ML，Wickliffe KE，Dong KC，et al. K11-linked polyubiquitination in cell cycle control revealed by a K11 linkage-specific antibody[J]. Mol Cell，2010，39(3)：477-484.

22 Choi YB，Harhaj EW. HTLV-1 tax stabilizes MCL-1 via TRAF6-dependent K63-linked polyubiquitination to promote cell survival and transformation[J]. PLoS Pathog，2014，10(10)：e1004458.

23 Udeshi ND，Svinkina T，Mertins P，et al. Refined preparation and use of anti-diglycine remnant (K-ε-GG) antibody enables routine quantification of 10，000s of ubiquitination sites in single proteomics experiments[J]. Molecular & Cellular Proteomics，2013，12(3)：825-831.

24 Chen Z，Zhou Y，Zhang Z，et al. Towards more accurate prediction of ubiquitination sites：a comprehensive review of current methods，tools and features[J]. Briefings in Bioinformatics，2015，16(4)：640-657.

25 Cai B，Jiang X. Computational methods for ubiquitination site prediction using physicochemical properties of protein sequences[J]. BMC Bioinformatics，2016，17(1)：1-12.

26 Mayor T，Lipford JR，Graumann J，et al. Analysis of polyubiquitin conjugates reveals that the Rpn10 substrate receptor contributes to the turnover of multiple proteasome targets[J]. Mol Cell Proteomics，2005，4(6)：741-751.

27 Shi Y，Chan DW，Jung SY，et al. A data set of human endogenous protein ubiquitination sites[J]. Mol Cell Proteomics，2011，10(5)：M110 002089.

28 Rubel CE，Schisler JC，Hamlett ED，et al. Diggin' on u(biquitin)：a novel method for the identification of physiological E3 ubiquitin ligase substrates[J]. Cell Biochem Biophys，2013，67(1)：127-138.

29 Gao Y，Li Y，Zhang C，et al. Enhanced purification of ubiquitinated proteins by engineered tandem hybrid ubiquitin-binding domains (ThUBDs)[J]. Mol Cell Proteomics，2016，15(4)：1 381-1 396.

30 Narayan S，Bader GD，Reimand J. Frequent mutations in acetylation and ubiquitination sites suggest novel driver mechanisms of cancer[J]. Genome Medicine，2016，8：55.

31 Sylvestersen KB，Young C，Nielsen ML. Advances in characterizing ubiquitylation sites by mass spectrometry[J]. Current Opinion in Chemical Biology，2013，17(1)：49-58.

32 Huttlin EL，Jedrychowski MP，Elias JE，et al. A tissue-specific atlas of mouse protein phosphorylation and expression[J]. Cell，2010，143(7)：1 174-1 189.

33 Maor R，Jones A，Nühse TS，et al. Multidimensional protein Ldentification technology (MudPIT) analysis of ubiquitinated proteins in plants[J]. Molecular & Cellular Proteomics，2007，6(4)：601-610.

34 Meierhofer D，Wang X，Huang L，et al. Quantitative analysis of global ubiquitination in heLa cells by mass spectrometry[J]. J Proteome Res，2008，7(10)：4 566-4 576.

35 Radivojac P，Vacic V，Haynes C，et al. Identification，analysis，and prediction of protein ubiquitination sites[J]. Proteins，2010，78(2)：365-380.

36 Xu G，Paige JS，Jaffrey SR. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling[J]. Nat Biotechnol，2010，28(8)：868-873.

37 Danielsen JM，Sylvestersen KB，Bekker-Jensen S，et al. Mass spectrometric analysis of lysine ubiquitylation reveals promiscuity at site level[J]. Mol Cell Proteomics，2011，10(3)：M110 003590.

38 Oshikawa K，Matsumoto M，Oyamada K，et al. Proteome-wide identification of ubiquitylation sites by conjugation of engineered lysine-less ubiquitin[J]. J Proteome Res，2012，11(2)：796-807.

39 Wagner SA，Beli P，Weinert BT，et al. A proteome-wide，quantitative survey of in vivo ubiquitylation sites reveals widespread regulatory roles[J]. Mol Cell Proteomics，2011，10(10)：M111 013284.

40 Kim W，Bennett Eric J，Huttlin Edward L，et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome[J]. Mol Cell，2011，44(2)：325-340.

41 Nguyen V-N，Huang K-Y，Huang C-H，et al. Characterization and identification of ubiquitin conjugation sites with E3 ligase recognition specificities[J]. BMC Bioinformatics，2015，16(1)：1-11.

42 Atkin G，Paulson H. Ubiquitin pathways in neurodegenerative disease[J]. Front Mol Neurosci，2014，7：63.

43 鄢 雯，李 囡，刘立新，等. 泛素-蛋白酶体系统在心肌肥厚中的研究进展[J]. 医学综述，2016，22(17)：3 329-3 333.

44 骆菁怡，张立婷，鲁明霞，等. Smurf2对肝纤维化中TGF-β/Smad通路的影响[J]. 医学综述，2015，21(17)：3 113-3 116.

45 窦忠霞，张晓梅，孟晓波，等. 泛素-蛋白酶体系统与线粒体关系研究进展[J]. 医学综述，2015，21(23)：4 258-4 260.

46 俞雯雯，史丽云. 泛素化调控与中药抗炎[J]. 医学综述，2014，20(21)：3 843-3 846.

47 Liu J，Shaik S，Dai X，et al. Targeting the ubiquitin pathway for cancer treatment[J]. Biochim Biophys Acta，2015，1855(1)：50-60.

48 Hoeller D，Dikic I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy[J]. Nature，2009，458(7 237)：438-444.

49 Yan J. Interplay between HDAC6 and its interacting partners：essential roles in the aggresome-autophagy pathway and neurodegenerative diseases.[J]. DNA Cell Biol，2014，33：567-580.

50 Suddason T，Gallagher E. A RING to rule them all? Insights into the Map3k1 PHD motif provide a new mechanistic understanding into the diverse roles of Map3k1[J]. Cell Death Differ，2015，22(4)：540-548.

51 李衍常，高 媛，徐忠伟，等. 蛋白质组学在去泛素化酶研究中的应用[J]. 生物工程学报，2014，30(9)：1 341-1 350.

Application of Ubiquitin Binding Domains in the Identification of Ubiquitination Target

WANG Jing-wei1，WU Jun-zhu2

1Department of Clinic Laboratory，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China;2Department of Biochemistry，School of Medicine，Wuhan University，Wuhan 430071，China

Ubiquitylation is the most complex post-translational modification in eukaryotes. The cellular processes modulated by ubiquitylation are deciphered by a specific ubiquitylated target by a 'downstream' ubiquitin receptor，which is also known as a ubiquitin-binding protein(UBP)，containing a class of specific ubiquitin binding domains(UBD). The fate or function of ubiquitylated target was determined by this specific UBD-ubiquitin interactions. Over twenty distinct ubiquitin-binding domain (UBD) families specifically recognize the motif one the ubiquitylated target surfaces.Therefore，it is of great significance to deeply understand the regulatory mechanisms of UBD-ubiquitin interactions for found out the new UBD and the deep mining of ubiquitinated proteome (ubiquitome).

Ubiquitin; Ubiquitin binding domain; Ubiquitome

武汉大学青年教师自主科研项目(2042015kf0113)

1武汉大学人民医院检验科，武汉 430060；2武汉大学基础医学院生物化学与分子生物学系，武汉 430071

本文2017-03-16收到，2017-06-28修回

R34 R446.1

A

1005-1740(2017)03-0073-07