Toll样受体4对高糖诱导胰岛微血管内皮细胞株凋亡蛋白表达的影响*

刘明明 张晓艳 武清斌 尚 飞 李炳蔚 李爱玲 李宏伟 修瑞娟

Toll样受体4对高糖诱导胰岛微血管内皮细胞株凋亡蛋白表达的影响*

刘明明 张晓艳 武清斌 尚 飞 李炳蔚 李爱玲#李宏伟 修瑞娟

目的：观察小鼠胰岛微血管内皮细胞(MS1)Toll样受体4(TLR4)的表达及其对高糖诱导凋亡蛋白表达的影响。方法：离体小鼠MS1分为低浓度葡萄糖(5.6mM)对照组(C组)、高浓度葡萄糖(25.0mM和35.0mM)诱导组(HG组)、TLR4抑制剂干预组(35.0mM葡萄糖+1μM CLI-095，HG+CLI组)及TLR4抑制剂对照组(5.6mM葡萄糖+1μM CLI-095，CLI组)。平行培养24h或48h后，先用CCK-8法检测C组和HG组MS1细胞活力，选定高糖干预浓度(35.0mM)及时间(48h)；再分别应用免疫组化和Western Blotting检测各组MS1细胞TLR4表达水平；应用Western Blotting检测各组MS1细胞凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3表达水平；应用明胶酶谱分析法检测基质金属蛋白酶2(MMP2)活性变化。结果：与C组比较，HG组MS1的TLR4蛋白表达显著增加(P<0.01)；凋亡蛋白Caspase-9和Caspase-3表达均显著升高(P<0.01，P<0.05)；MMP2活性明显增强(P<0.05)；与HG组比较，HG+CLI组Caspase-9水平均明显降低(P<0.01)，Caspase-3水平仅有降低趋势，差异无统计学意义(P>0.05)；TLR4的表达和MMP2活性虽有下降，但差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论：MS1高表达TLR4可能参与高糖诱导的MS1细胞凋亡。

胰岛微血管内皮细胞；Toll样受体4；细胞凋亡；基质金属蛋白酶；糖尿病

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)已成为我国最为严重的公共卫生问题之一。近年来研究表明，Toll样受体家族介导的免疫炎症反应可能与DM及其并发症的发生、发展密切相关。Toll样受体4(Toll-like receptors 4，TLR4)是参与先天免疫和慢性炎症反应的重要模式识别受体，表达于微血管内皮细胞表面，在调控微血管内皮细胞炎症反应、氧化应激和应对微循环剪切力等方面有重要作用，可能参与高糖对胰岛微血管内皮细胞(Mile Sven 1，MS1)的损伤及凋亡过程[1, 2]。本文观察TLR4在MS1的表达水平及其对高糖诱导微血管内皮细胞凋亡蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

MS1细胞株(CRL-2279，美国ATCC公司)；DMEM培养基(10567022，美国Gibco公司)；胎牛血清(11011，北京乾兆信业生物科技有限公司)；TLR4抑制剂CLI-095(TLRL-CLI95，美国InvivoGen 公司)；细胞增殖检测试剂盒CCK-8(C0037，江苏碧云天生物技术公司)；免疫组化试剂盒(MP-7601/7602，美国Vector公司)；BCA蛋白分析试剂盒(CW0014)、一步法快速Western Blotting试剂盒(CW2029)、高灵敏度ECL化学发光检测试剂盒(CW0049M，北京康为世纪生物科技有限公司)；半胱天冬酶Caspase-9抗体、Caspase-3抗体(95045、9662，美国Cell Signaling Technology公司)；TLR4抗体(sc-293072，美国Santa Cruz公司)；明胶酶谱分析试剂盒(HL30071.1，美国GENMED SCIENTIFICS公司)。

1.2 细胞培养及分组

MS1细胞常规复苏后用含5%胎牛血清的DMEM培养基(葡萄糖浓度5.6mM)，置于37 °C，5% CO2孵箱中培养，待细胞贴壁生长至单层铺满后以0.25%胰酶消化传代。再进行条件培养并据此分为4组：低浓度葡萄糖(5.6mM)对照组(C组)、高浓度葡萄糖(25.0mM和35.0mM)诱导组(HG组)、TLR4抑制剂干预组(HG+CLI组，35.0mM葡萄糖+1μM CLI-095)及TLR4抑制剂对照组(CLI组，5.6mM葡萄糖+1μM CLI-095)。每组样本均为3例，每个实验均重复3次。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 CCK-8法检测高糖对细胞增殖的影响：收集对数生长期MS1细胞，按2×103/孔将MS1细胞悬液接种于96孔板。分别给予25.0mM和35.0mM浓度葡萄糖干预24h、48h后每孔加入10μl CCK-8溶液，细胞培养箱内继续孵育1h，450nm处测定吸光度(OD)。OD值大小与细胞增殖活力成正比，即OD值越大，细胞增殖活力越强。

1.3.2 免疫组化分析TLR4蛋白表达：单层融汇的各组MS1细胞经胰酶消化后按5×104/孔密度接种于Lab-Tek Chamber Slide(丹麦Nunc公司)培养24h，无血清培养基同步化4h后条件培养48h。PBS洗涤3次，10%甲醛室温固定30min ，晾干备用。免疫组化检测按试剂盒说明进行，已固定的MS1经自来水洗5次，BLOXALLTM封闭液封闭10min ；PBS洗涤5次，2.5%羊血清孵育20min；TLR4抗体(按1∶50稀释)孵育90min，PBS洗5min；羊抗鼠二抗孵育15min，PBS洗涤5次；ImmPRESS抗羊IgG孵育30min ，PBS洗涤5次；显微镜下DAB显色10min，终止后自来水冲洗并经苏木素复染后封片。显微镜(德国Leica公司)下采集图像，应用Image J(ver 1.44)图像分析软件(美国国立卫生研究院)进行TLR4阳性表达区域光密度(IOD)分析。棕黄色染色为阳性表达。

1.3.3 Western Blotting 检测TLR4、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达：各组细胞生长至80%-90%融合时，换用无血清培养基同步化4h。条件培养48h，常规抽提总蛋白，按BCA蛋白分析试剂盒说明书检测蛋白浓度。点样20μg，经10% SDS-PAGE电泳并转膜后，分别加入一抗(TLR4 1∶100、Caspase-9和Caspase-3 1∶500稀释)和二抗(1∶1 000稀释)。4℃过夜，隔日洗膜后应用ECL化学发光法显示蛋白条带。经凝胶成像仪(上海Tanon-4200)采集图像，应用Image J图像分析软件分析各组MS1细胞蛋白条带与β-actin OD比值表示MS1蛋白表达水平。

1.3.4 明胶酶谱法分析基质金属蛋白酶2(matrix metal proteinase 2，MMP 2)活性：各组细胞生长至80%-90%融合时，换用无血清培养基同步化4h，条件培养48h后收集细胞培养上清。按照试剂盒说明书将等体积细胞上清加入非变性SDS电泳上样缓冲液中，经10% SDS-PAGE(含0.1%明胶) 电泳分离后，依次置于洗脱液1h、复性液20h后，37 °C 50rpm振摇。室温下考马斯亮蓝染色1h，脱色液适当脱色后，MMP2在蓝色背景上呈透亮条带，亮度越高，活性越高。应用凝胶成像系统采集电泳图，使用Image J软件以IOD值表示各组MS1细胞MMP2活性，并分析各组MS1细胞MMP2活性与C组的比值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 不同浓度葡萄糖对MS1细胞活力的影响

以C组OD值1.00为参照，平行比较两种高糖培养不同时间的MS1活力水平。表1结果表明，与C组相比较，25.0mM高糖培养组24h和48h的MS1细胞OD值均降低(t=6.023，P<0.01和t=3.666，P<0.05)，35.0mM时降低更加显著(t=44.130、13.190，均P<0.01)。而相同高糖浓度培养24h和48h的MS1细胞OD值差异均无统计学意义(t=0.828、1.392，均P>0.05)。提示35.0mM葡萄糖培养48h对MS1增殖活力影响最显著。故后续用此条件进行有关实验。

表1 25.0mM/35.0mM葡萄糖培养的MS1细胞活力比较(OD值，均=3)

注：与C组相同时点比较，1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 各组MS1细胞TLR4蛋白表达

2.2.1 免疫组化结果：各组MS1细胞膜均存在TLR4表达，以HG组最多(图1)。方差分析表明，四组间TLR4表达差异有统计学意义(F=11.86,P<0.01)。两组间比较，HG组TLR4表达IOD值(23.92±0.79)较C组(17.71±0.59)明显增高(t=10.89,P<0.01)，HG+CLI组IOD值(21.74±2.58)较HG组减少，但差异无统计学意义(t=1.398，P>0.05)，CLI组IOD值(15.84±2.47)与C组相近(t=1.275，P>0.05)。见图2。

注：棕黄色颗粒为TLR4表达阳性细胞。C组MS1细胞TLR4阳性表达较少；HG组MS1细胞TLR4阳性表达增加；HG+CLI组MS1细胞TLR4阳性表达较HG组减少；CLI组MS1细胞TLR4阳性表达与C组相近

注：与C组比较，*P <0.01

2.2.2 Western Blotting结果：各组MS1均存在TLR4表达，以HG组最多。方差分析表明，四组间TLR4表达差异有统计学意义(F=3.752,P<0.05)。两组间比较，HG组MS1的TLR4表达的IOD值(0.98±0.08)较C组(0.78±0.02)明显升高(t=3.505,P<0.05)，HG+CLI组TLR4表达水平(0.91±0.13)较HG组虽有降低趋势，但差异无统计学意义(t=0.616,P>0.05)，CLI组(0.85±0.04)与C组相近(t=2.306,P>0.05)。见图3。

2.3 各组MS1凋亡蛋白表达

如图4、图5所示，四组间凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9表达IOD值差异均有统计学意义(F=7.427，P<0.05和F=14.450，P<0.01)。两组间比较，HG组IOD值较C组Caspase-3(1.18±0.05 vs 0.85±0.05)及Caspase-9(0.91±0.03 vs 0.65±0.01)均显著升高(t=4.572，P<0.05和t=7.526，P<0.01)，HG+CLI组IOD值Caspase-3(0.87±0.10)较HG组虽有降低趋势, 但差异无统计学意义(t=2.738，P>0.05)；HG+CLI组Caspase-9 IOD值(0.55±0.02)较HG组明显下降(t=9.104，P<0.01)。CLI组Caspase-3(0.79±0.03)和Caspase-9(0.61±0.07)IOD值与C组差异无统计学意义(t=1.083、0.4472，均P>0.05)。

注：与C组比较，*P<0.05

注：与C组比较，*P<0.01；与HG组比较，#P<0.01

2.4 各组MS1细胞MMP2活性

结果表明，四组MMP2活性差异有统计学意义(F=5.070，P<0.05)。两组间比较，HG组较C组MMP2活性明显增高(8.09±1.41 vs 3.90±0.32，t=2.91，P<0.05)；HG+CLI组MMP2活性(4.79±0.64)较HG组虽有降低趋势, 但差异无统计学意义(t=2.137，P>0.05)，CLI组MMP2活性(4.26±0.65)与C组相近(t=0.510,P>0.05)。见图5。

注：与C组比较，*P<0.05

3 讨论

TLR4是目前研究最为广泛的Toll样受体家族成员，主要表达于巨噬细胞、中性粒细胞及树突状细胞等免疫细胞表面[2]，介导多种信号通路，诱导炎症因子释放及炎症反应发生。文献报道DM患者体内TLR4和TLR4配体表达水平均上调[3]，提示TLR4及其信号通路的异常激活可能参与高糖毒性介导的组织和器官局部炎症反应，引起胰岛素抵抗和胰岛β细胞凋亡等重要病变，还会损伤胰岛微血管内皮细胞，而内皮细胞对于维持胰岛β细胞正常生理功能至关重要。本研究结果证实胰岛来源的微血管内皮细胞株MS1较少存在TLR4表达，但高糖刺激可上调其表达水平。表明TLR4高表达是TLR4信号通路异常激活的分子基础之一，由此导致的胰岛微循环局部炎症和胰岛微血管内皮细胞功能障碍，可能是胰岛微血管内皮细胞活性降低、凋亡蛋白表达上调的机制之一[4, 5]。

我们前期的动物体内实验表明，DM小鼠MS1凋亡水平显著上调，TLR4参与了高糖诱导的细胞凋亡[6]，其机制可能与TLR4/髓样分化因子88(MyD88)/核转录因子-κB(NF-κB)/Caspase信号转导途径激活有关，TLR4可促使活性氧生成增多，并通过Caspase-1前体(pro-Caspase-1)、Caspase-1和Caspase-3等凋亡蛋白介导细胞凋亡[7-9]；高糖还能抑制巨噬细胞蛋白激酶B磷酸化，活化凋亡蛋白Caspase-3，导致细胞凋亡[8]。本次体外实验结果证实高糖可上调MS1 Caspase-9、Caspase-3凋亡蛋白表达水平；而应用特异性TLR4抑制剂CLI-095，阻断了TLR4胞内结构域介导的信号转导[10]或抑制了TLR4配体依赖和非依赖性信号通路，原因可能是CLI-095可下调高糖诱导的MS1细胞凋亡蛋白Caspase-9的高表达，提示TLR4高表达及其信号通路激活可能参与高糖诱导的MS1凋亡蛋白的高表达和细胞凋亡。

MMPs是降解细胞外基质的一组蛋白酶，以MMP2最为重要。MMPs可裂解微血管内皮细胞膜表面重要蛋白受体胞外域(如血管内皮生长因子受体、胰岛素受体)，导致微血管内皮细胞功能障碍和胰岛素抵抗[11, 12]。本研究结果表明，高糖可上调MS1的MMP2活性，而TLR4抑制剂有降低高糖诱导的MMP2活性趋势，提示TLR4及其信号通路可能通过上调MMP2表达并增强其酶活性参与微血管内皮细胞功能障碍及凋亡病理过程。

综上，高糖可抑制MS1增殖活力；TLR4可上调Caspase-3/9凋亡蛋白表达水平并增强MMP2活性；TLR4抑制剂可下调Caspase-9表达，降低MMP2活性。因此，TLR4及其信号通路可能成为DM治疗中发挥微血管内皮细胞保护作用的靶点之一。已有研究报道针对该靶点还采用了TLR4抗体Fab段[13]、α-抗胰蛋白酶[14, 15]、中草药[16]、免疫抑制剂和抗炎药[17, 18]等药物，其具体作用机制及临床疗效仍需进一步研究，为从微循环角度治疗DM做出贡献。

本文第一作者简介：

刘明明(1985-)，男，汉族，博士，助理研究员，研究方向：微循环在糖尿病、高血压发病机制中的作用

1 Wada J, Makino H. Innate immunity in diabetes and diabetic nephropathy[J]. Nat Rev Nephrol, 2016, 12(1):13-26.

2 Salvador B, Arranz A, Francisco S, et al. Modulation of endothelial function by Toll like receptors[J]. Pharmacol Res, 2016, 108:46-56.

3 Dasu MR, Devaraj S, Park S, et al. Increased toll-like receptor (TLR) activation and TLR ligands in recently diagnosed type 2 diabetic subjects[J]. Diabetes Care, 2010, 33(4):861-868.

4 Goligorsky MS, Chen J, Brodsky S. Workshop: endothelial cell dysfunction leading to diabetic nephropathy : focus on nitric oxide[J]. Hypertension, 2001, 37(2 Pt 2):744-748.

5 Ido Y, Carling D, Ruderman N. Hyperglycemia-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells: inhibition by the AMP-activated protein kinase activation[J]. Diabetes, 2002, 51(1):159-167.

6 Liu M, Zhang X, Li A, et al. Insulin treatment restores islet microvascular vasomotion function in diabetic mice [J]. J Diabetes，[in press].

7 Huang Z, Zhuang X, Xie C, et al. Exogenous hydrogen sulfide attenuates high glucose-induced cardiotoxicity by inhibiting NLRP3 Inflammasome activation by suppressing TLR4/NF-kappaB pathway in H9c2 cells[J]. Cell Physiol Biochem, 2016, 40(6):1 578-1 590.

8 Li M, Lin F, Lin Y, et al. Extracellular polysaccharide from Bordetella species reduces high glucose-induced macrophage apoptosis via regulating interaction between caveolin-1 and TLR4[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 466(4):748-754.

9 Krakauer T. Inflammasome, mTORC1 activation, and metabolic derangement contribute to the susceptibility of diabetics to infections[J]. Med Hypotheses, 2015, 85(6):997-1 001.

10 Kawamoto T, Ii M, Kitazaki T, et al. TAK-242 selectively suppresses Toll-like receptor 4-signaling mediated by the intra-cellular domain[J]. Eur J Pharmacol, 2008, 584(1):40-48.

11 Wang B, Li BW, Li HW, et al. Enhanced matrix metalloproteinases-2 activates aortic endothelial hypermeability, apoptosis and vascular rarefaction in spontaneously hypertensive rat[J]. Clin Hemorheol Microcirc, 2014, 57(4):325-338.

12 Delano FA, Zhang H, Tran EE, et al. A new hypothesis for insulin resistance in hypertension due to receptor cleavage[J]. Expert Rev Endocrinol Metab, 2010, 5(1):149-158.

13 Wang M, Zheng W, Zhu X, et al. A Human anti-Toll like receptor 4 fab fragment inhibits lipopolysaccharide-induced pro-inflammatory cytokines production in macrophages[J]. PLoS One, 2016, 11(1):e0146856.

14 Dasu MR, Park S, Devaraj S, et al. Pioglitazone inhibits Toll-like receptor expression and activity in human monocytes and db/db mice[J]. Endocrinology, 2009, 150(8):3 457-3 464.

15 Gottlieb PA, Alkanani AK, Michels AW, et al. alpha1-Antitrypsin therapy downregulates toll-like receptor-induced IL-1beta responses in monocytes and myeloid dendritic cells and may improve islet function in recently diagnosed patients with type 1 diabetes[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2014, 99(8):E1 418-1 426.

16 Li J, Wei X, Xie Q, et al. Protective effects of 2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione isolated from Averrhoa carambola L. (Oxalidaceae) roots on high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice[J]. Cell Physiol Biochem, 2016, 40(5):993-1 004.

17 Han LP, Li CJ, Sun B, et al. Protective effects of celastrol on diabetic liver injury via TLR4/MyD88/NF-kappaB signaling pathway in type 2 diabetic rats[J]. J Diabetes Res，[in press].

18 Lin M, Yiu WH, Li RX, et al. The TLR4 antagonist CRX-526 protects against advanced diabetic nephropathy[J]. Kidney Int, 2013, 83(5):887-900.

·医 学 前 沿·

CANTOS 研究：抗炎药物首次显示心血管疾病二级预防疗效

2017-06-22，美国诺华制药公司宣布旗下 CANTOS 研究 III 期临床结果，该研究评估了 ACZ885(Canakinumab，康纳单抗)对于心血管疾病患者的有效性、安全性和耐受性。

该研究共入组10 061名既往有心肌梗死，并且超敏 C 反应蛋白 ≥ 2mg/L 的动脉脉粥样硬化的患者，平均随访 3.8 年。结果显示，在标准治疗基础上，合并 ACZ885 治疗可以降低患者初级终点指标：包括主要不良心血管风险事件、心血管死亡复合终点事件、非致死性心肌梗死和非致死性卒中风险。

在2015年，全球大约有 729 万人遭遇过心肌梗死。尽管使用了标准治疗方法，合并炎症性动脉粥样硬化的该类既往心梗病人中仍有 40% 的患者会再发心血管事件甚至猝死。这无疑大大加重了患者本人以及全球心血管疾病的负担。

诺华首席执行官表示，ACZ885 是首个也是唯一一个靶向炎症因子可以降低心血管风险的药物，后续将进行更多研究。

据了解，ACZ885 是一个选择性、高亲和性阻断人源白细胞介素-1β(IL-1β)的单克隆抗体。目前研究认为 IL-1β是促进动脉粥样硬化的关键炎性分子。ACZ885 在体内可以长效性阻断 IL-1β，从而降低体内的炎症反应水平。

来源：丁香园

Effect of Toll-like Receptor 4 (TLR4) on the Expression of Apoptotic Proteins in High Glucose induced Islet Microvascular Endothelial Cells

LIU Ming-ming, ZHANG Xiao-yan, WU Qing-bin, SHANG Fei, LI Bing-wei, LI Ai-ling#, LI Hong-wei, XIU Rui-juan

Key Laboratory of Microcirculation, Ministry of Health, Institute of Microcirculation, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100005, China;#

Objective: To investigate the expression of Toll-like receptor4 (TLR4) on islet microvascular endothelial cells (MS1) and to assess its effect on the expression of apoptotic proteins in high glucose induced MS1.Method: MS1 was divided into four groups according to the treatments by glucose and TLR4 signaling inhibitor CLI-095 as following: 5.6mM glucose treated group (C group), 25.0mM and 35.0mM glucose treated groups (HG group), TLR4 inhibitor treated group (35.0mM glucose plus 1 μM CLI-095, HG+CLI group) and TLR4 inhibitor control group (5.6mM glucose plus 1 μM CLI-095, CLI group). After cultured for 24 h or 48 h, cell viability of C group and HG group was determined by CCK-8 to identify the optimal concentration (35.0mM) and intervention time (48 h) of high glucose. Then, the expression of TLR4 was determined by immunohistochemistry and Western Blotting and the expressions of apoptotic proteins (Caspase-9 and Caspase-3) were determined by Western Blotting.MMP2 was evaluated by gelatin enzyme spectrum analysis.Results: Compared with C group, the expression of TLR4 in HG group increased significantly (P<0.01), the expressions of Caspase-9 and Caspase-3 were significantly higher in HG group than those in C group (P<0.01 andP<0.05, respectively), meanwhile MMP2 activity increased significantly (P<0.05) in HG group. Compared with HG group, the expressions of Caspase-9 decreased significantly (P<0.01) in HG+CLI group, however no significant decreases were found on Caspase-3 expression, TLR4 expression and MMP2 activity between HG group and HG+CLI group (P>0.05) although there were decreased tendencies.Conclusion: High expression of TLR4 in MS1 associates with high glucose induced MS1 apoptosis.

Islet microvascular endothelial cell; Toll-like receptor 4; Apoptosis; Matrix metal proteinase; Diabetes

协和青年基金和中央高校基本科研业务费专项资助(333201065,3332015200)

中国卫计委微循环重点实验室，中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所，北京100005；#

，E-mail: lialwork@imc.cams.cn

本文2017-02-16收到，2017-05-30修回

R363.2

A

1005-1740(2017)03-0016-06