急性髓系白血病中环氧化酶-2、野生型P53的相关性分析

陈少微，陈秀花，覃艳红，徐智芳，许莲蓉*

(山西医科大学第二医院，山西 太原 030001)

急性髓系白血病中环氧化酶-2、野生型P53的相关性分析

陈少微，陈秀花，覃艳红，徐智芳，许莲蓉*

(山西医科大学第二医院，山西 太原 030001)

目的 分析环氧化酶-2 (COX-2)和野生型P53(WT-p53)在急性髓系白血病(AML)中表达相关性和意义。方法 采用RT-qPCR检测COX-2和WT-p53在AML患者中的表达情况。结果 比较21例正常对照、37例初发AML和24例复发AML患者中COX-2 mRNA的相对表达量分别为1.09±0.09、2.36±0.39、4.82±0.58，而WT p53 mRNA分别为0.99±0.13、0.48±0.06、0.20±0.05，均有统计学意义(P＜0.05)。COX-2和WT p53在AML中呈负相关，这与外周血白细胞计数和骨髓原始细胞比例有关。结论 COX-2过表达和WT p53低表达与AML复发有关，炎症微环境可能通过调控两者的表达及相互作用导致AML的复发。

白血病，髓样，急性；环氧化酶-2；野生型P53；复发；炎症

0 引言

急性髓系白血病(AML)是造血干祖细胞异常增殖和分化障碍所致的恶性克隆性疾病，复发是其治疗难题，目前机制尚不明确。研究发现，AML复发可能与炎症微环境有关[1]，炎症微环境中存在大量免疫细胞及促炎因子，可激活多种信号通路，这些刺激使环氧化酶-2 (COX-2)表达上调，则基因异常，促进细胞异常增殖、保护细胞免受凋亡等，增加潜在致瘤性。故本研究采用实时荧光定量PCR技术检测初发和复发AML患者中COX-2和野生型P53 (WT p53)的表达水平，并研究两者的表达相关性及与患者临床特征的关系，旨在探讨可能导致AML复发的机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

随机收集2016年3月至9月我院血液科的骨髓标本共82例。除外急性早幼粒细胞白血病(APL)和行造血干细胞移植的AML患者61例，包括初发组37例和复发组24例；其中男31例，女30例；中位年龄44岁(15-74岁)。诊断标准参照文献[2]。以21例同期骨髓良性疾病患者为对照组，其中男11例，女10例，中位年龄42岁(20-67岁)。

1.2 实验方法

1.2.1 标本处理

取患者骨髓标本2ml于EDTA管中，提取单个核细胞，采用Trizol法提取RNA。

1.2.2 引物设计与合成

Primer Premier 5.0软件设计RT-qPCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。(表1)

1.2.3 RT-qPCR检测

取2μl总RNA，按照PrimeScript® RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒说明进行逆转录，合成cDNA。取2μl的cDNA，按照SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒说明配制20μl的扩增体系，ABI7300进行扩增，β-actin为内参照。PCR扩增条件：预变性95℃ 30 s，1个循环；95℃ 5s变性，60℃ 31s退火延伸，40个循环。每个标本重复3次。Ct值为每个反应体系中荧光信号强度达到预设阈值时的循环数。采用2-ΔΔCt法，相对表达量RQ=2-ΔΔCt，ΔΔCt =(Ct目的基因-Ct内参)实验组-(Ct目的基因-Ct内参)对照组。

表1 各基因引物序列

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5软件。计量资料采用表示。比较资料采用One-Way ANOVA分析及卡方检验。相关性采用Pearson相关检验。采用t-test检验分析两者与患者临床特征的关系。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AML中COX-2和WT p53的表达水平

对照组、初发组和复发组中COX-2的相对表达量分别为1.09±0.09、2.36±0.39、4.82±0.58，而 WT p53分 别 为 0.99±0.13、0.48±0.06、0.20±0.05。同对照组相比，AML中COX-2表达增高，WT p53表达下降；和初发组相比，两者的差异更显著，有统计学意义(前者χ2=7.544， P=0.023；后者χ2=10.87，P=0.0044) (图1-2)。

图1 -2 C O X-2和WT p 5 3在正常组、初发组和复发组的表达水平

2.2 COX-2和WT p53 的表达相关性

对 照 组 中，COX-2和WT p53无 相 关 性(r=0.029，P=0.8985)，初发组和复发组中，两者均呈负相关(初发组r=0.731，P＜0.0001；复发组r=0.677，P=0.0003) (图3-5)。

图3 -5 C O X-2和WT p 5 3在正常组、初发组和复发组的表达相关性

2.3 COX-2、WT p53表达水平与患者临床特征的关系

AML患者中COX-2、WT p53表达水平与年龄、性别、血小板计数、血红蛋白浓度均无关（P＞0.05）。复发组中，随着外周血白细胞计数和骨髓原始细胞比例增高，COX-2表达增高，而WT p53表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；初发组中无此差异（表2）。

表2 C O X-2和WT p 5 3表达水平与患者临床特征的关系

表2 C O X-2和WT p 5 3表达水平与患者临床特征的关系

临床特征 初发组 RQ P值（各组间）≥60且＜90 2.05±0.28 0.49±0.43 4.44±0.56 0.20±0.07≥30且＜60 2.55±0.12 0.39±0.15 5.04±0.18 0.12±0.08 PLT（109/L）≥40 2.13±0.76 0.50±0.35 ＞0.05 3.92±0.19 0.31±0.11 ＞0.05＜40 2.52±0.51 0.44±0.17 4.22±0.56 0.22±0.13骨髓原始细胞比例（%）≥50 3.45±0.68 0.39±0.10 ＞0.05 5.52±0.61* 0.10±0.05* ＜0.05＜50 2.43±0.91 0.55±0.29 4.09±0.21 0.35±0.15复发组RQ P值（各组间）2.96±0.44 0.46±0.12 ＞0.05 4.46±0.08 0.23±0.02 ＞0.05女2.30±0.45 0.33±0.22 5.06±0.45 0.18±0.12年龄≥60 2.53±0.49 0.49±0.32 ＞0.05 4.52±0.39 0.21±0.06 ＞0.05＜60 2.16±0.22 0.44±0.12 4.89±0.22 0.19±0.02 WBC（109/L）≥10 2.52±0.02 0.44±0.43 ＞0.05 5.02±0.41Δ 0.11±0.05Δ ＜0.05＜10 1.99±0.87 0.34±0.22 4.12±0.33 0.39±0.11 HB（g/L）≥90 2.13±0.31 0.44±0.12＞0.05 COX-2 WT p53 COX-2 WT p53性别男4.50±0.21 0.28±0.06＞0.05

3 讨论

王晓军等发现COX-2在慢性粒细胞白血病中表达增高，与肿瘤负荷和病情演变有关[3]。高子芬等也发现在经典型霍奇金淋巴瘤中COX-2过表达率达53.8%，是影响患者无事件生存期的独立不良预后因素[4]。本研究也证实在AML中COX-2表达增高，且复发组高于初发组，这提示AML复发可能与COX-2过表达有关。

激活COX-2过表达的内源性和外源性刺激，同时也调控WT p53的表达，两者的启动子都需通过NF-κB信号转导通路激活，因此COX-2和WT p53表达存在一定的关联[5]。Gharghabi等将COX-2抑制剂塞来昔布作用于肺癌细胞株，24小时后发现MDM-2表达下降，WT p53表达上调，说明WT p53/MDM-2负反馈通路被阻断，抑制肺癌细胞生长；而在48小时后WT p53表达下降，COX-2和MDM-2表达均增加，提示WT p53和COX-2表达存在负反馈调控作用[6]。故本研究对同一研究对象WT p53表达水平进行检测，发现在AML中WT p53表达是降低的。通过分析COX-2和WT p53表达相关性，发现在AML中两者确实呈负相关。

通过分析两者与患者临床特征的关系，明确外周血白细胞计数和骨髓原始细胞比例的增高是影响COX-2和WT p53负调节的因素。一方面证实COX-2和WT p53相互作用导致白血病细胞增殖，致AML复发；另一方面我们推测COX-2和WT p53的相互作用可能与炎症有关。在正常炎症反应中，炎症病变使NF-κB信号转导通路激活，致DNA损伤，则WT p53激活致无特异性诱导凋亡，两者共同上调COX-2的表达，使正常细胞免受WT p53诱导的细胞凋亡；一旦WT p53诱导凋亡作用消失，TATA盒就下调COX-2表达，恢复机体正常生理功能[7]。而AML患者经化疗后多免疫功能低下，是慢性非可控性炎症的易感人群，慢性非可控性炎症长期作用于机体形成炎症微环境[8]，处于炎症微环境下，WT p53和COX-2动态平衡被打破，持续表达的COX-2负反馈调控WT p53表达，而炎症因子持续反式激活胞苷脱氨酶使TATA盒功能异常[9]，过表达的COX-2发挥炎-癌转化桥梁作用，诱导体细胞突变；大多数突变体细胞被淘汰，少数则通过体细胞突变和炎症相关表观遗传修饰等改变信号转导模式，经去分化而获得干细胞特性，发展为致癌起始细胞[10]，推测白血病干细胞由此而来。故我们推测炎症微环境激活WT p53后上调COX-2的表达，过表达的COX-2负反馈调控WT p53表达，并发挥炎-癌转化桥梁作用，致AML复发。

本研究证实，COX-2过表达和WT p53低表达与AML复发有关，而炎症微环境调控两者相互作用可能是导致AML复发的机制之一，这为AML复发的研究提供新的思路。

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The Correlation Analysis of COX-2 and WT-p53 Expression in Acute Myeloid Leukemia

CHEN Shao-wei, CHEN Xiu-hua, TAN Yan-hong, , XU Zhi-fang, XU Lian-rong*

The Second Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Taiyuan 030001, China.

Objective To analyze correlation and clinical significance of cyclooxygenase-2 (COX-2) and Wild type p53 (WT-p53) in acute myeloid leukemia (AML). Methods Expression level of COX-2 and WT-p53 was detected by RT-qPCR. Results The average relative quantity of COX-2 mRNA in 21 normal control patients, 37 incipient patients and 24 relapsed patients were 1.09±0.09, 2.36±0.39 and 4.82±0.58, respectively; while that of WT p53 in three groups were 0.99±0.13, 0.48±0.06, 0.20±0.05, respectively. COX-2 expression was negatively correlated with WT p53 expression in AML. This relationship was correlated with peripheral blood leukocyte count and leukemia cell percentage. Conclusions COX-2 over-expression and WT p53 low expression are related to the development of AML. The inflammatory micro-environment may lead to the recurrence of AML by regulating the expression and interaction of both.

Leukemia; Myeloid; Acute; Cyclooxygenase-2; WT p53; Relapse; Inflammation

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.08.36