肝细胞癌患者外周血Th22细胞检测及临床意义

郝猛，施珍，刘晓峰，孙午

(九江市第一人民医院/南昌大学附属九江医院检验科，江西九江332000)

肝细胞癌患者外周血Th22细胞检测及临床意义

郝猛，施珍，刘晓峰，孙午

(九江市第一人民医院/南昌大学附属九江医院检验科，江西九江332000)

目的探讨肝细胞癌患者外周血Th22细胞表达水平及其临床意义。方法抽取52例肝细胞癌患者、38例慢性乙型肝炎患者、32例健康对照者外周血标本，采用流式细胞术检测Th22细胞水平，ELISA法检测IL-22水平，分析肝细胞癌组Th22细胞、IL-22与肿瘤标志物AFP、CEA、CA199的相关性。结果外周血Th22细胞和IL-22水平在肝细胞癌组、慢性乙型肝炎组显著高于健康对照组（P＜0.05），肝细胞癌组略高于慢性乙型肝炎组（P＞0.05）；肝细胞癌患者外周血Th22细胞和IL-22水平存在正相关（r=0.342，P＜0.05），而外周血Th22细胞、血浆IL-22水平与肿瘤标志物AFP、CEA、CA199均无相关性（P＞0.05）。肝细胞癌组HBV阴、阳性患者间Th22细胞和IL-22水平比较均具有统计学差异（P＜0.05）。结论Th22细胞在肝细胞癌外周血中呈高水平表达，且与乙型肝炎病毒携带可能相关，但与血清肿瘤标志物无相关性，提示该细胞可能参与了肝细胞癌的发生和进展。

肝细胞癌；Th22细胞；IL-22；相关性

肝癌是人类常见的恶性肿瘤，也是癌症患者死亡的主要病因之一。流行病学研究证实肝癌发生率持续上升，我国原发性肝癌在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第二位；原发性肝癌90%以上为肝细胞癌(HCC），而乙型肝炎病毒(HBV)长期慢性感染是肝细胞癌的主要致病因素。原发性肝癌发生是一个多因素多阶段的复杂过程，大部分CD4+T细胞参与原发性肝癌的发病和进展过程，其发病与进展的免疫机制尚不明确，但已有国内外学者开始研究炎症因子在肝癌发生发展中的作用。Th22细胞亚群是近年来新发现的一类CD4+T细胞亚群，以高水平分泌IL-22，不产生IL-17或IFN-γ为特点，在许多感染及自身免疫性疾病表达上调；在炎症反应、自身免疫性疾病、肿瘤及移植排斥反应中发挥重要的作用[1，2]。IL-22是由Th22等免疫细胞产生并以皮肤、肝脏、胰腺等组织细胞为靶细胞的细胞因子，IL-22在肝炎产生和肝癌形成以及组织修复过程中起重要的免疫病理作用[3-5]。因此我们采用流式细胞术检测HCC患者外周血中Th22的表达并分析其与肝肿瘤标志物的相关性，以进一步探讨其在乙型肝炎病毒型HCC发病中的作用，为临床诊疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2014年6月-2015年12月九江市第一人民医院52例临床诊断肝细胞癌患者和38例慢性乙型病毒肝炎患者的外周血标本。肝细胞癌患者中男29例，女13例，平均年龄51.82±10.51岁，其中乙型肝炎病毒阳性患者41例；慢性乙型肝炎患者中男21例，女17例，平均年龄48.82±13.51岁。另收集32名健康对照人的外周血，其中男19例，女13例，平均年龄53.16±12.84岁。上述诊断均符合2009年制订的原发性肝癌诊断标准和2010年修订的肝硬化和病毒性肝炎诊断标准[6，7]。

1.2 仪器与试剂罗氏Cobas e601化学发光仪及配套检测试剂；BD FACSCantoⅡ流式细胞仪购自美国BD公司及由BD公司提供的抗人CD4、IL-22配套检测试剂；完全培养基RPMI 1640为Hyelone公司产品；淋巴细胞刺激混合液（佛波醇酯、离子霉素、莫能霉素）均购自Sigma公司；淋巴细胞分离液为杭州四季青生物工程公司产品；IL-22 ELISA试剂盒购自R&D公司。

1.3 Th22细胞检测方法入选病例于诊断成立后第2d从肘静脉抽取血液1ml置入肝素抗凝管中，加PBS液稀释1倍混匀后加入分离液Ficoll-Hypaque，以1500r/min离心10min，收集单个核细胞层于离心管中，取100μl单个核细胞与RPMI 1640培养液等体积稀释，加入淋巴细胞刺激剂混合液，置于37℃、5%CO2培养箱培养4h，取各组标本单个核细胞用FACS缓冲液(含2%FCS和0．1%叠氮钠的PBS)洗涤2次，加入抗人PE-CY7-CD4抗体，室温避光孵育30min；固定破膜后，加入抗人PE-IL-22抗体，加入同型对照抗体，室温避光孵育30min，重悬后采用BD CantoⅡ流式细胞仪检测，FACS Diva7.0软件分析流式检测结果，用Th22细胞占外周血CD4+细胞的比例来评价Th22细胞的水平。AFP、CEA、CA199、IL-22检测项目按照标准作业流程(SOP)文件操作进行检测。

1.4 统计学处理采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间两两比较采用单因素方差分析。各组间的差异采用t检验进行分析，Th22与常见临床指标的相互关系采用Spearman检验分析；所有假设检验均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血Th22细胞水平比较流式细胞术检测结果显示肝细胞癌组Th22细胞占外周血CD4+细胞比例为（7.18±2.09）%，明显高于健康对照组的（2.32±1.12）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；慢性乙型肝炎组Th22细胞占外周血CD4+细胞比例为（5.92±1.76）%，也明显高于健康对照组的（2.32± 1.12）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；肝细胞癌组与慢性乙型肝炎组无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

2.2 外周血IL-22水平比较ELISA结果检测显示肝细胞癌组外周血IL-22为（808.68±171.64）pg/ ml，明显高于健康对照组的（235.45±81.52）pg/ml，差异有统计学意义（P＜0.05）；慢性乙型肝炎组外周血IL-22为（671.54±153.66）pg/ml，也明显高于健康对照组的（235.45±81.52）pg/ml，差异有统计学意义（P＜0.05）；肝细胞癌组与慢性乙型肝炎组无统计学差异（P＞0.05）。见表1。进一步与Th22细胞比例进行相关性分析，显示肝细胞癌组和慢性乙型肝炎组患者外周血Th22细胞比例与IL-22水平均呈正相关（r=0.342，P＜0.05；r=0.318，P＜0.05）。

表1 各组间外周血Th22细胞和IL-22水平比较（x±s）

2.3 肝细胞癌组Th22细胞和IL-22水平与肿瘤标志物相关分析结果显示肝细胞癌患者外周血Th22和IL-22水平存在相关性（r=0.342，P＜0.05），而血浆Th22和IL-22水平与肿瘤标志物AFP、CEA、CA199均无相关性（P＞0.05）。见表2，表3。

表2 Th22细胞与肿瘤标志物相关分析（n=52）

表3 IL-22与肿瘤标志物相关分析（n=52）

2.4 肝细胞癌组HBV阴、阳性患者Th22细胞和IL-22水平比较乙型肝炎病毒阳性肝细胞癌组与乙型肝炎病毒阴性肝细胞癌组外周血Th22细胞水平比较具有统计学差异（P＜0.05）；乙型肝炎病毒阳性肝细胞癌组与乙型肝炎病毒阴性肝细胞癌组IL-22水平比较也具有统计学差异（P＜0.05）。见表4。

表4 肝细胞癌组HBV阴阳性患者Th22和IL-22水平

3 讨论

Th22细胞是最早于2009年由Duhen T等[8]和Trifari S等[9]发现的一类与皮肤免疫功能相关的CD4+T细胞功能亚群，其免疫表型CCR6+、CCR4+和CCRl0+，它独立于Thl、Th2和Thl7，不分泌IFN-γ、IL-17、IL-4，主要分泌IL-22、IL-26、IL-13等细胞因子，其功能主要通过IL-22来实现[3]。IL-22主要由Th22和Thl7细胞亚群产生，其中Th22细胞分泌量可达总IL-22水平的65%；IL-22不直接作用于免疫细胞，其受体分布于皮肤、肾脏、肝脏、呼吸道及消化道等组织细胞，参与这些系统疾病的病理过程[10]。IL-22与其受体复合物结合后引起信号转导，诱发J激酶1(JAKl)、酪氨酸激酶2(Tyk2)及细胞外信号调节激酶(ERK)活化，进而激活信号转导子及转录激活子3(STAT3)及少量STATl、STAT5等。IL-22激活JAK-STAT3信号通路后，可诱导组织细胞多种基因表达上调，这些基因涉及组织重塑、血管生成、纤维化形成等。在肝脏，STAT3被激活后会诱导急性时相基因、抗菌蛋白基因、凋亡抑制基因和增值相关基因表达，故IL-22表现为肝脏保护、促有丝分裂、甚至肿瘤形成等作用[11-13]。

Jiang R等[5]的研究表明，IL-22在人类肝细胞癌(HCC)中高表达，血清中IL-22表达水平在慢性肝病和HCC中显著增高，提示Th22细胞可能在肝细胞癌和慢性肝病的T细胞介导的免疫相关。本研究结果显示肝细胞癌组、慢性乙型肝炎组中外周血Th22和IL-22水平均明显高于健康对照组，肝细胞癌组高于慢性乙型肝炎组，提示Th22细胞可能参与肝细胞癌的发病及进展过程[14]。有研究显示猿人类免疫缺陷病毒（SHIV）感染猕猴后，发现Th22表达水平在SHIV慢性感染后再次感染疟疾时较SHIV与疟疾共同感染时高出200倍，并与其预后明显相关[15]，提示Th22表达水平与病毒感染有一定的关系。但在HBV感染后如何变化，目前还无相关研究。Park O等[4]发现IL-22在乙肝和丙肝患者中高表达，可提高肝细胞的存活率，也可加速慢性病毒性肝炎患者肝细胞癌变。这说明HCC患者微环境中IL-22高表达，IL-22通过活化STAT3信号通路，提高Bcl-xl基因、B淋巴细胞瘤2基因、细胞周期蛋白D1和血管内皮生长因子的表达，而这些蛋白的表达最终可促进血管生长和细胞增殖，抑制细胞凋亡，从而促进恶性肿瘤的生长和转移，但分析肝细胞癌组Th22细胞和IL-22水平与肝肿瘤标志物均无相关性[16]，与本实验结果相一致。本研究还发现，乙型肝炎病毒阳性肝细胞癌组与乙型肝炎病毒阴性肝细胞癌组外周血Th22、IL-22水平比较均具有统计学差异，结果表明Th22细胞在肝细胞癌中的表达水平可能与乙肝病毒携带有关，Jiang R等[5]通过长期反复DEN诱导小鼠模拟了肝炎发展到肝癌的反复损伤修复过程，发现IL-22水平的随肿瘤的形成逐渐升高；提示慢性HBV感染时，IL-22的升高可能既提高了肝细胞的存活率，又加速肝炎向肝癌的转化[17]。但考虑到本实验组的病例数较少，还需临床大量样本研究证实。

综上所述，Th22细胞作为新近发现的效应CD4+T细胞亚群，在慢性乙型肝炎和肝细胞癌中的作用还不太明确[18]。虽然有文献报道IL-22在刀豆蛋白、四氯化碳等介导的T细胞肝炎中起减轻细胞损伤、促进细胞增殖和加速组织修复等保护作用，但也有证据表明IL-22在慢性乙型肝炎中促进炎症的发生和诱导肝癌的形成。目前Th22细胞在肝细胞癌的相关性研究很少，深入研究探讨Th22细胞在乙型肝炎型肝细胞癌的发生机制，可能为乙型肝炎相关性肝细胞癌的预防、早期诊断和靶向免疫治疗提供更有效的临床诊断价值。

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The Detection and Significance of Th22 Cells in Peripheral Blood of Hepatocellular Carcinoma Patients

HAO Meng，SHI Zheng，LIU Xiaofeng，SUN Wu.Depratment of Clinical Laboratory，First People's Hospital of Jiujiang City/Jiujiang Affiliated Hospital of Nanchang University，Jiujiang Jiangxi 332000，China.

Objective To investigate the expression of Th22 cells in peripheral blood of hepatocellular carcinoma patients and its clinical significance.Methods The peripheral blood were collected from 38 cases with chronic hepatitis B and 32 healthy controls.The expression level of Th22 cells in blood samples was detected by flow cytometry(FCM)；the IL-22 was detected by an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The potential interrelationship of Th22 cells，IL-22 in peripheral blood and tumor markers including AFP，CEA and CA199 was performed.Results The expression level of Th22 cells and IL-22 in peripheral blood of hepatocellular carcinoma group and chronic hepatitis B group were significantly higher than those of healthy control group (P＜0.05)，which of the hepatocellular carcinoma group were slightly higher than those of the chronic hepatitis B group(P＞0.05).The percentage of Th22 cells in hepatocellular carcinoma group had the positive correlation with the level of IL-22(r=0.342，P＜0.05)，while the expression level of Th22 cells and IL-22 had no correlation with tumor markers including AFP，CEA and CA199(P＞0. 05).Additionally，the expression level of Th22 cells and IL-22 bore significant difference in the HBV-negative and-positive hepatocellular carcinoma patients(P＜0.05).ConclusionTh22 cells in the peripheral blood of hepatocellular carcinoma patients showed high expression level，with which hepatitis B virus carrying might be related，but not serum tumor markers.The results suggested that the Th22 cells might participate in pathogenesis and progression of hepatocellular carcinoma.

∶Hepatocellular carcinoma；Th22 cells；IL-22；Correlation analysis

R446.62，R735.7

A

1674-1129(2017)04-0499-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.014

2016-12-12；

2017-04-30)

郝猛，男，1983年生，医学检验专业，大学本科，学士学位，主管检验技师。