纳米载银抗菌凝胶对常见牙周致病菌的体外抑菌作用*

杜岩张林祺李金生张涛

纳米载银抗菌凝胶对常见牙周致病菌的体外抑菌作用*

杜岩张林祺李金生张涛

目的：观察新型纳米载银抗菌凝胶对常见牙周致病菌的体外抑菌作用。方法：采用琼脂扩散法观察新型纳米纳米载银抗菌凝胶(实验组)对牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、具核梭杆菌、放线伴放线杆菌等的体外抑菌作用，同时分别以盐酸米诺环素软膏和空白载体作为阳性和阴性对照。结果：纳米载银抗菌凝胶对牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、具核梭杆菌、放线伴放线杆菌的抑菌环直径均值分别为：14.4±1.14mm，15.2±0.84mm，14.2±1.10mm，14.8±0.84mm，与盐酸米诺环素软膏相比没有明显统计学差异。结论：新型纳米载银抗菌凝胶对常见牙周致病菌在体外有抑菌作用，抑菌效果与盐酸米诺环素软膏类似。

纳米载银抗菌剂；盐酸米诺环素；抑菌作用；牙周致病菌

牙周疾病是最常见的口腔疾病[1]。牙周致病菌在一定条件下诱发牙周疾病。常见的牙周致病菌包括：牙龈卟啉单胞菌(Porphyromanus gingivalis, P.g.)、中间普氏菌(Prevotella intermedia，P.i.)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，F.n.)、放线伴放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，A.a.)等[2]。牙周疾病的治疗离不开抗菌制剂，但目前的抗菌制剂多是抗生素，不当使用容易产生耐药性，本试验观察了一种无机抗菌剂(以新型纳米载银抗菌剂制备的凝胶制剂，下称纳米载银抗菌凝胶[3])对常见牙周致病菌的体外抑菌作用，并与盐酸米诺环素软膏相对比。

1.材料与方法

1.1 纳米载银抗菌凝胶的制备[3]取卡波姆940(南京威尔化工有限公司，批号20160105)1.0 g置适量纯化水中充分溶胀，搅匀备用，得溶液A，另取纳米载银抗菌剂(西安康旺抗菌公司，主要成分为载银磷酸锆，批号20100103)2g加于纯化水，同时滴加乳酸(湖北西银和生物科技有限公司，批号20160301)，边加边搅拌，至无机抗菌剂恰好完全溶解，加入甘油(湖北迈源化工有限公司，20160410)及丙二醇(陕西圣瑞医药科技有限公司，20160215)，搅匀，得溶液B。将B液缓缓加人A液中并不断搅拌，加纯化水至100g，用0.1mol/L氢氧化钠(徐州金川药用辅料有限公司，20160509)溶液调节pH值为6.5-7.0，继续搅拌均匀，得无机抗菌凝胶剂。同时制备不含无菌抗菌剂的空白载体。

1.2 阳性对照组试剂盐酸米诺环素软膏(派力奥，新时代株式会社，注册证号：H20100244，批号20160421)。活性成分10mg/支，占2%。

1.3 抑菌试验[4,5]

试验菌株本试验菌株为国际标准菌株。P.g. (ATCC33277)、P.i.(ATCC25611)、F.n.(ATCC10953)、A.a.(ATCC43718)均购自四川大学华西口腔医院国家重点微生物实验室。

1.3.1 抑菌片的制备取无菌并干燥的滤纸片，制成直径为5mm，厚不超过4mm圆片，每5片一组。每片滴加实际使用浓度无机抗菌剂溶液(实验组A组)、盐酸米诺环素软膏溶液(阳性对照B组)或空白载体凝胶液(空白对照C组)20μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱(37℃)中烤干后备用。

1.3.2 试验菌的接种将4种试验菌常规复苏，传代培养，取少量菌落接种于BHI液体培养基内，37℃厌氧培养24h，取100μL菌液，用Vitek细菌比浊仪稀释至浓度106CFU/mL待用。取300μL稀释菌液于CDC琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好培养皿，置室温干燥5min。

1.3.3 抑菌剂样片贴放每种细菌培养皿贴放1个染菌平板，平板内贴放3片试验样片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距20mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好培养皿，置37℃温箱，培养16h观察结果。

1.3.4 用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录。试验重复5次。测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。

1.4 结果判定[6]

抑菌环直径小于8mm为无抑菌作用，抑菌环直径大于等于8mm小于12mm为低度敏感，抑菌环直径大于等于12mm小于16mm为中度敏感，抑菌环直径大于等于16mm为高度敏感。

1.5 统计分析

使用SPSS17.0进行统计分析，采用方差分析比较纳米载银抗菌凝胶和盐酸米诺环素软膏对4种牙周致病菌的抑菌环直径，结果以(x±sd)表示，检验水准α=0.05。

2.结果

2.1 各组抑菌环数据见表1。

表1 各实验组抑菌环直径(mm)比较结果(x±sd)

实验菌株对纳米载银抗菌凝胶均为中度敏感。纳米载银抗菌凝胶对同一种实验菌株的抑菌环直径与盐酸米诺环素凝胶相比没有明显统计学差异，而明显优于空白对照。

2.2 各组培养皿抑菌环图片见图1-图4。

图1 P.g.组培养皿抑菌环图片

图2 P.i.组培养皿抑菌环图片

图3 F.n.组培养皿抑菌环图片

图4 A.a.组培养皿抑菌环图片

3.讨论

人群中牙周炎症的患病率高达90%以上[1]，局部给药在牙周疾病治疗中有其独特优势，用药次数少、局部药物浓度高、持续时间长、可减少全身用药的不良刺激和反应。

目前市场上最常用的抗菌药膏(膜)类剂型是盐酸米诺环素软膏(派丽奥)[7]，但该制剂是抗生素制剂，长期使用有产生耐药性的风险，临床上有必要开发新型无耐药风险的抗菌制剂。与抗生素相比，无机抗菌剂是一种广谱高效的抗菌剂，金属抗菌离子一般附载在缓释性载体上,在使用过程中具有抗菌性能的金属离子逐渐释放,接触细菌，破坏其细胞壁。在低浓度下金属离子就有抗菌效果。而且它不会有耐药性，储藏条件宽松，与各种化学试剂不产生物理化学变化，将其制成合适的剂型在口腔科具有广泛的用途。本课题组前期已经制成了一种无机抗菌剂——纳米载银抗菌凝胶，具有良好的物理性能，具有制备简单，应用方便，具水溶性，缓释，无油腻性，质量容易控制等特点。该制剂组方中卡波姆940添加0.5g、0.75g、1g、1.25g、1.5g后，观察发现添加1g，所得凝胶的粘稠度与流动性更符合应用需求。添加甘油、丙二醇是稳定剂与促进透皮吸收的作用。本实验进一步观察了纳米载银抗菌凝胶对常见牙周致病菌的体外抑菌作用，为其临床应用提供理论依据。

本实验结果表明，纳米载银抗菌凝胶对4种牙周致病菌具有抑菌作用，抑菌能力与盐酸米诺环素软膏相当。纳米载银抗菌凝胶的主要成分为纳米级的载银无机抗菌剂，它是在纳米材料基础上，由无机离子交换体与具有较强杀菌能力的银离子化合制成[3]。本实验所用纳米载银抗菌凝胶的有效成分浓度约为20mg/mL，有实验表明，纳米载银无机抗菌剂对常见口腔病原菌的最小杀菌浓度较低，在2.5-40mg/mL之间[8]，本实验进一步验证了纳米载银抗菌凝胶对牙周致病菌的抑菌作用，要提高凝胶的抑菌作用，可以通过提高纳米载银无机抗菌剂的浓度来实现，但需要考虑到其潜在的毒性问题。虽然有文献支持纳米载银无机抗菌剂具有良好的生物安全性[9,10]，但也有文献指出，随着剂量的增加，纳米载银无机抗菌剂可能对细胞/机体造成毒性[11,12]。彭晖等研究表明，纳米银可以引起EBF (人胚胎干细胞自然分化而来的成纤维细胞)的形态异常，表现为细胞皱缩，突触收起，细胞间距增大。CCK-8和细胞周期检测结果显示，纳米银的细胞毒性呈时间和浓度依赖性[13]。因此，纳米银抗菌凝胶的临床应用仍需要进一步研究其在临床应用的可能性，同时探索出一个合适的药物浓度，既满足临床需要，又能规避其可能存在的潜在毒性。

[1]齐小秋.第三次全国口腔健康流行病学抽样调查报告[M].北京：人民卫生出版社，2005:1-25

[2]孟焕新.牙周病学[M].第4版，北京：人民卫生出版社，2013: 23-31

[3]张林祺，张涛，张昀，等.无机抗菌凝胶剂的制备与检测[J].临床合理用药，2015，8(2)：14-15

[4]李飞飞，吴国丽，布紫云，等.一种纳米银抑菌喷剂的杀菌效果观察[J].中国消毒学杂志，2015，32(11)：1074-1076

[5]梁泽鑫，苗晓琳，柯军，等.壳聚糖抗菌成膜喷剂杀(抑)菌效果的试验观察[J].中国消毒学杂志，2014，31(10)：1045-1049

[6]张冠民，唐燕，谷群英，等.牙周续补固齿汤提取成分对4种牙周致病菌的抑菌实验[J].北京口腔医学，2014，22(4): 204-207

[7]牛宇，胡敏，吕源.米诺环素局部用药治疗老年慢性牙周炎的疗效观察[J].中华老年口腔医学杂，2006，4(4):206-207

[8]张林祺，高勃，杨聚才，等.三种纳米载银无机抗菌剂对口腔致病菌的抗菌活性比较[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2006，16(5):254-256

[9]佘文珺，傅远飞，张富强.纳米载银无机抗菌剂对义齿基托树脂细胞毒性的影响[J].上海交通大学学报，医学版，2006，26 (10):1102-1104

[10]Alt V,Becheret T,Steinrucke P,et al.An in vitro assessment of the antibacterial properties and cytotoxicity of nanoparticulate silver bone cement[J].Biomaterials，2004，25(18): 4383-4391

[11]Kim YS,Kim JS,Cho HS,et al.Twenty-eight-day oral toxicity,genotoxicity,and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats[J].Inhalation toxicology,2008，20(6):575-583

[12]Sung JH,Ji JH,Yoon JU,et al.Lung function changes in Sprague-Dawley rats after prolonged inhalation exposure to silver nanoparticles[J].Inhalation toxicology,2008,20(6): 567-574

[13]彭晖，俞光岩，李盛林，等.纳米银对人胚干细胞来源的成纤维细胞的细胞毒性评价研究[J].现代口腔医学杂志，2012, 26(3):171-174

The bacteriostasic activity of nano-slilver based inorganic antibacterial gel to periodontal pathogens in vitro

DU Yan,ZHANG Lin-qi,LI Jin-sheng,ZHANG Tao(Department of Stomatology,PLA general Hospital,Beijing 100853, Chian)

Objective:To investigate the bacteriostasic activity of nano-slilver based inorganic antibacterial gel to the common periodontal pathogens in vitro.Methods:The agar diffusion method was used to investigate the bacteriostasic activity of nano-slilver based inorganic antibacterial gel(test group)to the common periodontal pathogens.The pathogens included werePorphyromanus gingivalis(P.g.),Prevotella intermedia(P.i.),Fusobacterium nucleatum(F.n.),Actinobacillus actinomycetemcomitans(A.a.).minocycline gel and the blank vehicle was investigated as positive and negative control respectively at the same time.Results:The diameters of the bacterial inhibition ring of test group were14.4±1.14 mm, 15.2±0.84 mm,14.2±1.10 mm,14.8±0.84mmfor P.g.,P.i.,F.n.,A.a.,respectively.There were no significant difference between the test group and positive control.Conclusion:The nano-sliver based inorganic antibacterial gel have the similar baceriostasic activity to the common periodontal pathogens with minocycline.

nano-silver based inorganic antibacterial agent;minocycline;bacteriostasis;periodontal pathogens

R781.4

A

1672-2973(2017)04-0221-03

2017-03-21)

军队青年培育课题基金项目(项目编号：14QNP100)

杜岩解放军总医院口腔科主治医师北京100853

张林祺通讯作者解放军260医院口腔科主任副教授河北050041

李金生解放军260医院药剂科主任副主任药师河北050041

张涛解放军260医院药剂科药师河北050041