人脱落乳牙牙髓干细胞与牙髓干细胞生物学功能差异研究

庞真贞王良高磊刘钦赞李晔

人脱落乳牙牙髓干细胞与牙髓干细胞生物学功能差异研究

庞真贞王良高磊刘钦赞李晔

目的：从不同角度对人乳牙牙髓干细胞(SHED)与恒牙牙髓干细胞(DPSCs)的生物学功能进行对比研究，探讨对骨改建的影响。方法：有限稀释法分离培养SHED和DPSCs，成脂诱导14d进行油红O染色、成骨诱导21d进行茜素红染色；ELISA法检测IL-6、TNF-α分泌水平；两种干细胞常规培养及成骨诱导7d后进行ALP染色、实时定量PCR检测Runx2、RANKL、OPG基因表达。结果：分离获得的SHED和DPSCs具有成骨、成脂分化能力，符合干细胞特点。SHED的炎性细胞因子IL-6、TNF-α的表达均高于DPSCs(P＜0.01)；成骨诱导7d后SHED的ALP活性强于DPSCs(P＜0.05)；且经成骨诱导后两种干细胞均表达Runx2、OPG和RANKL，但SHED的表达水平明显高于DPSCs(P＜0.05)。结论：SHED与DPSCs相比不仅具有较强的成骨分化能力，而且兼具较强的破骨能力，提示SHED可能参与骨改建调控机制。

人脱落乳牙牙髓干细胞；牙髓干细胞；TL-6；Runx2

干细胞是指具有克隆形成能力的未分化细胞，有自我更新和多向分化的特点。目前，用于组织修复和再生的间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSC)多采用成体多能干细胞[1]。近年来，牙源性干细胞逐渐成为学者关注的热点，Gronthos等[2]于2000年成功分离了人恒牙牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells，DPSCs)，随后，Miura等[3]从正常脱落的儿童乳牙中分离得到一种间充质干细胞[4]，并命名为人脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)。二者皆具有成体干细胞的特性，细胞表面表达多种间充质干细胞特异性标记物且具有较强的增殖能力和多向分化潜能[5]。乳牙与恒牙在来源和成牙特性上相近，然而，在结构和组织学上有一定差异，近期有研究证实与DPSCs相比SHED增殖能力强，倍增时间短，且具有较高克隆形成能力及成骨分化能力[6]，但具体作用机制不清。本研究通过对比SHED和DPSCs的功能差异关键因子的分泌表达，为探讨SHED有可能参与骨的改建调控机制提供实验依据。

1.材料和方法

1.1 主要试剂和仪器胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、α-MEM培养基(Gbico，美国)、0.25%胰蛋白酶(上海雅心，中国)、青链霉素、链霉素(Gibco，美国)；RNA提取试剂盒、TNF-αElisa试剂盒(上海通蔚生)、逆转录试剂盒(Fermentas，美国)；TRIzol Reagent(Life Technologies，NY)；IL-6；ALP试剂盒(上海碧云天)；超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，中国)；实时定量PCR仪(Applied Biosystems 7500，美国Life Technologies公司)。

1.2 收集样本收集2014年12月至2015年2月保定市第一中心医院口腔科5-7岁儿童，正常乳恒牙替换期自然脱落的乳牙样本。脱落乳牙无明显龋坏，牙髓病变及根尖周炎，根吸收达到牙根1/2-2/3，且所有纳入个体均无系统性疾病。同期于口腔外科与正畸科收集18-25岁青年因埋伏阻生拔除的第三磨牙或因正畸治疗拔除的前磨牙样本。所取得恒牙均无明显龋坏，牙髓病变及根尖周病变，且所有纳入个体均无系统疾病。本研究经保定市第一中心医院伦理委员会批准，且取得患者知情同意。

1.3 SHED和DPSCs的分离与培养在充分消毒乳、恒牙牙体周围组织后拔牙，即刻置入预冷含高倍双抗α-MEM培养基中，2h内原代取材。参照Gronthos2等的方法，在超净工作台中，PBS液反复冲洗牙齿，拔髓针直接拔取乳牙牙髓组织；用牙钻从牙冠打开恒牙髓腔后，拔髓针拔取牙髓。用含有青、链霉素双抗的0.1mL/L PBS反复冲洗，剪成约1mm3大小的组织块，4%Ⅰ型胶原酶消化组织块45min，加入含150mL/LFBS及含双抗的DMEM培养液终止消化，1000r/min离心5min，弃上清，加入含20%胎牛血清的α-MEM培养液接种于35 mm培养皿中，常规培养2d后半量换液，之后每隔2-3d半量换液，待细胞量达80%-90%汇合时，按1∶3比例用胰酶消化传代。应用有限稀释法对SHED进行克隆分离：计数处于第一代对数期的SHED，有限稀释至密度为约10个/mL，以100μl/孔接种于96孔培养板内，培养24h后，挑出单个细胞的孔继续培养，每隔3d用含15%FBS的α-MEM培养液半量换液；待单克隆面积增至孔底60%以上时，消化法转移至24孔板、6孔板中继续扩大培养，逐步扩增至107数量级，以P3代细胞用于实验。

1.4 成骨成脂分化取P3代的SHED和DPSCs计数后，以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，将其随机分为实验组与对照组，每组3孔。待细胞生长至60%-70%密度时将其进行成骨、成脂诱导。成骨分化：用含有地塞米松10μmol/L、β磷酸甘油钠10mmol/L、vitC 50μmol/L、FBS 100mL/L的DMEM诱导液培养，每2-3d换液，21d后，40g/L的多聚甲醛固定1.5h，PBS液漂洗3遍，加入茜素红37℃环境中染色30-45min，PBS冲洗后显微镜下观察。成脂诱导：用含有地塞米松1μmol/L、IBMX 0.5μmol/L，胰岛素10mg/L、吲哚美辛200μmol/L、FBS 100mg/L的DMEM诱导液诱导培养14d后，在显微镜下观察胞浆内出现圆形空泡后，弃诱导液，PBS漂洗3遍将细胞用40g/L的多聚甲醛常温固定30min。PBS漂洗3遍后，置于油红O工作液中15-20min，蒸馏水冲洗5遍，镜下观察。

1.5 细胞因子检测将第三代的SHED和DPSCs以1×105个/ml密度接种于24孔板中，分别设置4个副孔。待细胞贴壁后，弃原培养液，PBS冲洗3遍，将SHED及DPSCs加入含15%胎牛血清、0.292mg/ml谷氨酰胺、100μmol/L抗坏血酸、100U/ml青、链霉素双抗的α-MEM培养基，24h后收集各个培养孔内的培养液进行离心，取上清液进行酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。分别按照IL-6、TNF-α ELISA检测试剂盒说明建立标准曲线后每孔加入100μl待测样品，洗板，加入50μl一抗工作液，反应板充分混匀后置于37℃60min，洗板后加入100μl底物液，置于37℃避光保存10min，最后每孔加入终止液50μl混匀，在450nm处测吸光值。本实验进行3次重复。

1.6 碱性磷酸酶染色将P3代SHED及DPSCs以1×104个/孔的密度接种于12孔板中，随机分为实验组与对照组，每组3孔。正常培养及成骨诱导，每3d换液培养至7d时，弃原培养液，PBS液冲洗3遍，4%多聚甲醛固定液固定30min。PBS液冲洗3遍，加入ALP染液37℃孵育45min。蒸馏水轻轻冲洗去染液，拍照。显微镜下观察染色结果，呈蓝色为阳性。

1.7 实时定量PCR将P3代SHED与DPSCs低密度接种于T25培养瓶内，在常规培养条件及成骨诱导条件下培养7d，后用Trizol裂解并提取成骨总RNA，逆转录为cDNA。采用SYBR Green试剂盒进行荧光定量PCR检测，目的基因及管家基因在不同的反应管中进行扩增，反应体系20μl。反应条件：95℃变性20min，95℃30s，60℃1min，40个循环。采用实时荧光定量PCR仪监测记录数据，结果根据标准曲线，软件自动计算后得出。试验重复3次。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.8 统计学分析采用SPSS 19.0软件对数据处理，比较两组间的数据采用独立样本t检验。设P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1 SHED与DPSCs均具有成脂、成骨分化能力经过低密度接种培养获取的SHED和DPSCs具有干细胞的基本形态，细胞均成长梭形、胞浆均匀、核圆、核仁清晰，呈旋涡状生长。SHED及DPSCs在向成骨方向诱导过程中，细胞形态发生了明显变化，胞体增大，突触消失，形态接近方形或多边形，经成骨诱导21d后茜素红染色呈阳性结果，可见矿化结节。SHED及DPSCs经成脂诱导培养14d后，胞浆内出现圆形空泡，并逐渐融合，油红O染色可见呈红色的脂滴颗粒(图1)。这说明我们所分离培养的细胞符合SHED及DPSCs特性，为下一步实验打下了基础。

图1 SHED和DPSCs成脂、成骨诱导分化(×200)

2.2 SHED和DPSCs TNF-α、IL-6分泌量及基因表达水平检测TNF-α、IL-6在干细胞参与的骨改建过程中发挥一定作用，本研究首先采用Elisa方法检测SHED及DPSCs TNF-α、IL-6分泌量，结果显示，常规培养条件下SHED TNF-α、IL-6分泌量显著高于DPSCs(P＜0.01)(图2A)。实时定量PCR对TNF-α、IL-6在两组细胞中表达的检测结果与Elisa结果一致，SHED TNF-α、IL-6分泌量显著高于DPSCs，其中SHED TNFα的表达水平是DPSCs的3.11倍(P＜0.01)(图2B)。

图2 A：ELISA检测细胞因子分泌水平；B：SHED和DPSCs常规培养3d后提取RNA检测炎症相关基因表达*和DPSCs相比，P＜0.01

2.3 SHED和DPSCs成骨诱导7d后ALP染色将SHED和DPSCs成骨诱导7d后进行ALP染色，大体观察可见SHED和DPSCs经成骨诱导后ALP染色较常规对照组有所增强。镜下观察，多数细胞质有蓝紫色颗粒沉淀，且SHED较DPSCs染色深，由此可见SHED较DPSCs ALP阳性表达率高(图3)。

图3 SHED和DPSCs成骨诱导7d后ALP染色(100倍)

2.4 SHED与DPSCs经成骨诱导7d后关键基因表达检测实时定量PCR结果显示，SHED及DPSCs均表达成骨早期关键的转录因子基因Runx2。常规培养条件下SHED Runx2表达水平显著高于DPSCs，成骨诱导7d后两组细胞Runx2表达水平均显著升高(P＜0.05)，SHED成骨诱导组表达值最高(图4A)。常规条件下SHED和DPSCs OPG表达无显著差异，成骨诱导后均显著上调，成骨诱导后SHED OPG表达水平显著高于DPSCs成骨诱导组(P＜0.05)(图4B)。在RANKL表达上，成骨诱导7d后DPSCs较对SHED组降低，SHED增高4.37倍(P＜0.05)(图4C)。

3.讨论

儿童乳牙生理性根吸收是乳恒牙替换期的一种自然的生理现象，关于乳牙生理性根吸收的机制，有学者提出可能与炎症环境、继承恒牙萌出时的压力或咬合创伤有关，但目前均处于探索阶段。现阶段对根吸收的研究大多倾向于乳牙自身相关组织，因此乳牙牙髓干细胞成为当前的研究热点。

图4 SHED和DPSCs成骨、破骨相关基因表达*和DPSCs相比，P＜0.05

有研究表明，乳牙的生理性根吸收过程与骨重塑的过程相似。本实验选用Runx2及OPG两种成骨方向分化相关的特异性基因视为向成骨细胞分化的检测指标[7]，检测结果示，成骨诱导后，SHED和DPSCs的成骨相关基因Runx2和OPG表达量均较正常培养组有所提高，且SHED的Runx2和OPG表达增加量均明显高于DPSCs，本实验结果也再次验证SHED较DPSCs具有更强的成骨分化能力[8-9]。

TNF-α为TNF家族重要成员之一，是目前公认的最重要的一个内源性诱生型促炎细胞因子，现有研究结果显示，炎性因子能够影响成骨细胞特异性基因的表达、细胞外基质的分泌以及成骨细胞的凋亡，且对破骨细胞的形成和活性具有重要的调节作用[10，11]。有实验表明，TNF也可以刺激基质成骨样细胞合成IL-6、PTHrp以及RANKL表达促进破骨细胞发育。本实验的研究结果显示，常规培养的DPSCs炎症因子TNF-α和IL-6的分泌量明显小于SHED,且在炎症相关基因的表达倍数上更是小于SHED。在骨的重塑过程中涉及经典的RANK/RANKL/OPG(核因子κB受体活化剂/ RANK配体/骨保护素)受体配体系统，在骨质代谢中发挥重要作用，且OPG和RANKL分别是破骨发生抑制因子与促进因子，RANKL与OPG的比值在破骨细胞分化成熟过程中有着重要作用[12]。RANK作为RANKL的受体，当RANKL与RANK结合后，启动传递破骨细胞分化信号，使破骨细胞前体细胞开始增殖、分化以及细胞融合，形成破骨细胞，从而促进骨质吸收；然而当RANKL的另一种受体OPG与RANKL结合后，会对破骨细胞的功能产生抑制作用，同时也会抑制破骨细胞前体细胞的进一步发育，从而抑制骨质的吸收。在本实验中，SHED与DPSCs均表达RANKL和OPG，但SHED在破骨相关基因RANKL的表达上呈上调趋势，且明显高于DPSCs。结果提示SHED相较于DPSCs具有更强的破骨能力。因此，本实验结果表明，与DPSCs相比，SHED不仅具有更强的成骨分化能力，还兼有一定的破骨能力。但其具体的调节机制尚不清楚，还需进一步研究。

[1]Gregorio Laino,Antonio Graziano,Riccardo d'Aquino,et al. An approachable human adult stem cell source for hard-tissue engineering[J].J Cell Physio,2005,206(3):693-701

[2]Gronthos S,Mankani M,Brahim J,et al.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(25):13625-13630

[3]Miura M,Gronthos S,Zhao M,et al.SHED:stem cells from human exfoliated deciduousteeth[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(10):5807-5812

[4]Junjun Liu,Fang Yu,Yao Sun,et al.Concise Reviews: Characteristics and Potential Applications of Human Dental Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells[J].St em Cells, 2015,33(3):627-638

[5]Vishwanath VR,Nadig RR,Nadig R,et al.Differentiation ofisolated and characterized human dental pulp stem cells and stem cells from human exfoliated deciduous teeth:An in vitro study[J].J Conserv Dent,2013,16(5):423-428

[6]Heng BC,Zhu S,Xu J,et al.Effects of decellularized matrices derived from periodontal ligament stem cells and SHED on the adhesion,proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in vitro[J].Tissue Cell,2016,48 (2):133-143

[7]Francesca Paino,Marcella Noce,Virginia Tirino,et al.Histone Deacetylase Inhibition with Valproic Acid Downregulates Osteocalcin Gene Expression in Human Dental Pulp Stem Cells and Osteoblasts:Evidence for HDAC2 Involvement[J]. Stem Cells,2014,32(1):279-289

[8]Zhu Y,Shang L,Chen X,et al.Deciduous dental pulp stem cells are involved in osteoclastogenesis during physiologic root resorption[J].J Cell Physiol,2013,228(1):207-215

[9]Bei Li,Yu Zhang,Qingchao Wang,et al.Periodontal Ligament Stem Cells Modulate Root Resorption of Human Primary Teeth via Runx2 Regulating RANKL/OPG System[J].Stem cells and development,2014,23(20):2524-2534

[10]de Araújo Júnior RF,Souza TO,de Medeiros CA,et al. Carvedilol decrease IL-1β and TNF-α,inhibits MMP-2, MMP-9,COX-2,and RANKL expression,and up-regulates OPG in a rat model of periodontitis[J].Plos One,2013,8(7): e66391-e66391

[11]吴莹莹,刘洪臣.TNF-α、IL-1β及IL-6与糖尿病及牙周炎之间的关系[J].中华老年口腔医学杂志，2011，9(2)：117-121

[12]Martin TJ.Historically significant eventsin the discovery of RANK/RANKL/OPG[J].World J Orthop,2013,4(4):186-197

Research differences of biological functions between stem cells from human exfoliated deciduous teeth and dental pulp stem cells

PANG Zhen-zhen,WANG Liang,GAO Lei,Liu Qin-zan,LI Ye(Department of Stomatology,Baoding First Central Hospital,Hebei 071000,China)

Objective:Research differences of biological functions between stem cells from human exfoliated deciduous teeth and dental pulp stem cells from different angles,to explore the influence of bone reconstruction.Methods:SHED and DPSCs were isolated,purified and cultured in vitro by limiting diluction,and oil red O staining at 14 days of adipogenic induction,alizarin red staining at 21 days of osteogenic induction;detect IL-6 and TNF-α secretion level by Elisa method; ALP staining at 7 days of two kinds of stem cells in conventional cultivation and osteogenic induced,and detect Runx2、RANKL and OPG gene expression by real-time PCR.Results:Both of SHED and DPSCs have abilty to adipogenic and osteogenic differentiation;conforms to the characteristics of the stem cells.SHED expression of IL-6 and TNF-α were higher than that of DPSCs(P＜0.05);Both kinds of stem cells express Runx2 OPG and RANKL after osteoinductive differentiation, but the expression of SHED obviously higher than that of DPSCs(P＜0.05).Conclusion:Compared with DPSCs,SHED has not only the ability of osteogenic differentiation but also an osteoclast capacity,remind that SHED may participate in the bone reconstruction.

human exfoliated deciduous dental pulp stem cells;dental pulp stem cells;TL-6；Runx2

R781

A

1672-2973(2017)04-0204-05

2017-02-23)

庞真贞保定市第一中心医院口腔科主治医师河北071000

王良保定市第一中心医院手术室护师河北071000

高磊保定市第一中心医院彩超室副主任医师河北071000

刘钦赞保定市第一中心医院口腔科医师河北071000

李晔保定市第一中心医院口腔科主任医师河北071000