Keggin型硅钨酸盐K4[α—SiW12O40]·17H2O体外抗肿瘤活性研究

陈梦+高莹雪++于娜+王晓晓++范美田++薛莹雪

[摘要]目的 合成Keggin型硅钨酸盐K4[α-SiW12O40]·17H2O（简称KSiW12），研究其体外抗肿瘤活性。方法 通过IR、UV等表征手段对其结构进行表征，并应用四甲基偶氮唑盐（3-[4，5-dimethylthiazo-2-y]-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）比色法分析KSiW12对人肝癌细胞（HepG2）以及人肺癌细胞（A549）的增殖抑制活性。采用光学显微镜观察两种肿瘤细胞在不同浓度药物作用后的形态变化。结果 Keggin型硅钨酸盐KSiW12对两种肿瘤细胞均有增殖抑制作用，具有药物浓度依赖性，对两种肿瘤细胞的IC50值分别为（7.5×10-5±3.2）mol/L和（1.7×10-4±3.8）mol/L。光学显微镜下经药物作用后的肿瘤细胞出现皱缩、变圆、缩小等形态变化。结论 硅钨酸盐KSiW12具有体外抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤细胞增殖。

[关键词]Keggin型；硅钨酸盐；抗肿瘤；体外研究

[中图分类号] R961 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）07（c）-0081-05

Study of anti-tumor activity in vitro of Keggin-type Silicotungstate K4[α-SiW12O40]·17H2O

CHEN Meng1 GAO Ying-xue2 YU Na1 WANG Xiao-xiao1 FAN Mei-tian1 XUE Ying-xue1▲

1.College of Pharmacy，Jilin Medical University，Jilin Province，Jilin 132013，China；2.College of Inspection，Jilin Medical University，Jilin Province，Jilin 132013，China

[Abstract]Objective To synthesize Keggin-type silicotungstate K4[α-SiW12O40]·17H2O （abbreviated form：KSiW12），and to study the in vitro anti-tumor activity.Methods The structure of KSiW12 was characterized by IR and UV.The inhibitory effect of KSiW12 on the growth of human hepatoma HepG2 cells and lung cancer A549 cells was studied by MTT（3-[ 4，5-dimethylthiazo-2-y]-2，5-diphenyltetrazolium bromide） assay.The morphological change in tumor cells affected by different concentration of drugs was observed by optical microscopes.Results KSiW12 could inhibited HepG2 and A549 cells proliferation，showing dose-dependent，with IC50 value of （7.5×10-5±3.2）mol/L and （1.7±10-4×3.8）mol/L，respectively.The morphological changes in tumor cells showed shrinking of cells and round cells under an optical microscope after treating with different concentrations of KSiW12.Conclusion KSiW12 can inhibit tumor cells growth.

[Key words]Keggin-type；Silicotungstate；Anti-tumor；Study in vitro

惡性肿瘤是危害人类生命健康的一种疾病，药物治疗在恶性肿瘤的治疗中占有重要地位。目前临床使用的多数抗肿瘤化学药物具有效率低、选择性差、毒副反应大及肿瘤细胞耐药等缺点，因此，研究开发高效、低毒的抗肿瘤药物乃当务之急。

多酸又称为聚金属氧酸盐（POM），由含氧酸盐经缩合脱水形成，是一类金属-氧簇合物，是由d0组态的过渡金属离子，如钼（MoⅥ），钨（WⅥ），钒（VⅤ），铌（NdⅤ），钽（TaⅤ）等与氧原子高度聚合形成的具有空间网络结构的无机高分子聚合物[1]。由于多酸具有许多特殊的性质，如体积大，热稳定性高，能传递并储存电子，分子量较高，晶格氧可以迁移以及电子结构多样性，使得其在催化、光学、磁学、医药、材料科学等领域发挥着越来越重要的作用[2-5]。近年来，多酸在抗病毒[6-7]、抗肿瘤[8-11]、抗菌[12]等方面的研究迅速地发展起来并取得显著成就，其中Keggin型结构的杂多酸盐因其特异的结构特征和较强的接受和转移电子能力，具有较好的抗肿瘤、抗病毒作用[13-14]。本研究参照文献[15]合成Keggin型结构的硅钨酸盐化合物K4[α-SiW12O40]·17H2O，选择人肝癌细胞（HepG2）以及人肺癌细胞（A549）对其增殖抑制活性进行研究。

1资料与方法

1.1仪器和试剂

IMPACT 400 FTIR型红外光谱仪（KBr压片）（美国NICOLET公司）；UV-1601PC型紫外分光光度计（日本SHIMADZU公司）；TDZ5-WS型低速离心机（湘仪实验室仪器开发有限公司）；HF90型CO2恒温细胞培养箱（上海力申科学仪器有限公司）；XDS1C型倒置生物显微镜（上海万衡精密仪器有限公司）；SW-CJ-1B型超净工作台（苏净集团苏州安泰空气有限公司）；680型酶标仪（美国BIORAD公司）；MH-2型微量振荡器（其林贝尔仪器制造有限公司）。

胰蛋白酶、DMSO、MTT（美国Sigma公司），胎牛血清、RPMI 1640培养基（GIBCO公司），双抗（青霉素钠、硫酸链霉素）（西安制药公司）。K4[α-SiW12O40]·17H2O采用1640培养液溶解，配制成浓度为10-2 mol/L的母液，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后-20℃保存。

1.2细胞培养

将人肝癌细胞（HepG2）以及人肺癌细胞（A549）（美国ATCC细胞库）培养于含10%小牛血清及青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 U/ml）的RPMI 1640培养基中，取对数生长期的细胞用于实验。

1.3 MTT法分析细胞增殖力

取对数生长期的肿瘤细胞，调细胞密度为105个/ml，按200 μl/孔加入到96孔培养板中，在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，将肿瘤细胞分成空白对照组和实验组，吸出培养液，实验组每孔加入药物溶液200 μl（药物的终浓度为10-5、10-4、2.5×10-4、5×10-4、10-3、2.5×10-3 mol/L），空白对照组每孔加入200 μl的1640培养液。每个浓度及对照均设3个复孔，放在培养箱中继续培养24 h，加入MTT试剂20 μl/孔，继续在培养箱内培养4 h使得MTT还原成为甲瓒。培养终止时，弃去上清液，加入DMSO 150 μl/孔，在微量振荡器上振荡10 min使甲瓒完全溶解，放入到酶标仪中，测定570 nm处的吸光值（OD值）。药物对肿瘤细胞增殖抑制率的计算公式为：增殖抑制率=（1-实验组OD值/空白對照组OD值）×100%，重复实验3次，取平均值。

1.4肿瘤细胞的形态学观察

取对数生长期的肿瘤细胞，培养24 h后，去上清液，将细胞分成空白对照组和实验组（药物的终浓度为10-5、10-4、2.5×10-4、5×10-4、10-3、2.5×10-3 mol/L），培养24 h后，将实验组与空白对照组于倒置显微镜下观察不同浓度药物对肿瘤细胞的影响，从生长抑制、细胞形态进行评估。

2结果

2.1红外光谱

利用傅立叶红外光谱仪对硅钨酸盐KSiW12进行结构表征，图1为KSiW12的红外谱图。从图中可以看出，KSiW12在1020、980、925、892、878、780、553、538、474、413 cm-1处有吸收峰。

图1 KSiW12的红外谱图

2.2紫外光谱

利用紫外分光光度计对硅钨酸盐KSiW12的结构进行进一步确定，图2为KSiW12的紫外谱图，从图中可以看出，KSiW12在200、260 nm处有吸收峰。

2.3不同浓度的KSiW12对肿瘤细胞形态学的影响

分别采用不同浓度10-5、10-4、2.5×10-4、5×10-4、10-3、2.5×10-3 mol/L的KSiW12处理肿瘤细胞，研究不同浓度的KSiW12对肿瘤细胞形态学的影响。处理24 h后，空白对照组的肿瘤细胞紧贴瓶底，生长密集，细胞间连接紧密，呈现规则的多边形，圆形细胞少。而经过药物KSiW12处理的肿瘤细胞，随着药物浓度的升高，由平滑的、有规则的形状逐渐变圆，出现皱缩、缩小等形态变化，并且增殖数目明显减少，细胞密度降低（图3、图4）。

2.4 MTT比色法分析肿瘤细胞增殖抑制率

由于活细胞的线粒体具有还原MTT形成紫色化合物的能力，该化合物在570 nm波长下有强吸收。细胞死亡或增殖功能下降时，还原MTT的能力下降，570 nm波长下吸光度值会降低。研究不同浓度的KSiW12对两种肿瘤细胞（人肝癌细胞HepG2以及人肺癌细胞A549）的增殖抑制效果，MTT比色法检测的结果如图5、图6所示。

从图中可以看出，硅钨酸盐KSiW12对HepG2和A549细胞均有明显的增殖抑制作用，并且随着药物浓度的增加，抑制率也相应地有所增大，具有药物浓度依赖性。随着药物作用时间的增长，KSiW12对HepG2和A549细胞的抑制作用逐渐增强，药物作用12 h时，最高抑制率分别为（84.0±2.2）%和（80.5±3.4）%；24 h时，最高抑制率分别为（89.0±2.5）%和（89.8±2.8）%；在药物作用48 h时，最高抑制率达到最大，分别为（90.1±3.3）%和（94.2±2.4）%，IC50值分别为（7.5×10-5±3.2）mol/L和（1.7×10-4±3.8）mol/L，提示硅钨酸盐KSiW12具有体外抗肿瘤活性。

3讨论

多酸的组成元素多样，从Mo、W、V等基本组成元素拓展到涵盖周期表中的70多种元素，并且结构种类繁多，主要有Keggin型、Dawson型、Silverton型、Ande？鄄rson型等结构，形成了结构多样的化合物，其对体内外病毒和肿瘤均表现出较高的抑制活性[16]。

本研究利用红外光谱和紫外光谱对KSiW12进行结构表征，从红外表征结果可以看出，KSiW12的红外吸收峰与文献[15]报道一致，并且在1000～700 cm-1范围内，980、925、878、780 cm-1处的吸收峰分别归属于W=Od键、Si-O键、W-Ob-W键和W-Oc-W键的特征峰[17]，是Keggin型结构杂多酸盐的红外特征吸收峰。从紫外表征结果可以看出，KSiW12的紫外吸收峰200 nm和260 nm分别归属于W=O键和W-O-W键的特征吸收峰，是Keggin型结构杂多酸盐的紫外特征吸收峰[17]。以上结果说明KSiW12具有Keggin型结构，为所要合成的目标化合物。

MTT实验结果以及光学显微镜下肿瘤细胞形态变化结果均说明，不同浓度的KSiW12作用于肿瘤细胞后，能够抑制肿瘤细胞增殖，在光学显微镜下，肿瘤细胞逐渐出现变圆、皱缩等形态变化，细胞密度逐渐减少，并呈药物浓度依赖性；而Keggin型杂多阴离子的抗肿瘤机制主要基于氧化还原反应，即肿瘤细胞表面一部分区域将WVI还原为WV，同时，肿瘤细胞表面的另一部分区域再氧化WV到WVI，肿瘤细胞在氧化还原的循环过程中被杀死[18-19]。由于肿瘤细胞和硅钨酸盐的作用过程比较复杂，抗肿瘤作用的具体机制尚需要进一步研究。

综上所述，KSiW12对人肝癌细胞（HepG2）以及人肺癌细胞（A549）均有增殖抑制作用，具有药物浓度依赖性，IC50值分别为（7.5×10-5±3.2）mol/L和（1.7×10-4±3.8）mol/L，半数有效浓度较小，具有进一步研究价值。光学显微镜下观察到，随着药物浓度的增加，肿瘤细胞逐渐出现变圆、皱缩、缩小等形态变化，并且细胞密度逐渐减少，提示硅钨酸盐KSiW12具有体外抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤细胞增殖，这为今后多酸药物在肿瘤治疗方面的研究应用提供了重要的实验数据。

[参考文献]

[1]Wang XH，Liu JF，Pope MT.New polyoxometalate/starch nano？鄄material：synthesis，characterization and antitumoral activity[J].Dalton Trans，2003，32（5）：957-960.

[2]Mizuno N，Misono M.Heterogeneous catalysis[J].Chem Rev，1998，98（1）：199-211.

[3]Lis S.Applications of spectroscopic methods in studies of polyoxometalates and their complexes with lanthanide（Ⅲ） ions[J].J Alloys Compd，2000，300-301（1）：88-94.

[4]Rhule JT，Hill CL，Judd DA，et al.Polyoxometalates in med？鄄icine[J].Chem Rev，1998，98（1）：327-357.

[5]Katsoulis DE.A survey of applications of polyoxometalates[J].Chem Rev，1998，98（1）：359-388.

[6]Shigeta S，Mori S，Kodama E，et al.Broad spectrum anti-RNA virus activities of titanium and vanadium substituted polyoxotungstates[J].Antivir Res，2003，58（3）：265-271.

[7]Barnard DL，Hill CL，Gage T，et al.Potent inhibition of res？鄄piratory syncytial virus by polyoxometalates of several stru？鄄ctural classes[J].Antivir Res，1997，34（1）：27-37.

[8]Zhang Y，Shen JQ，Zheng LH，et al.Four polyoxonibate-based inorganic-organic hybrids assembly from bicapped heteropolyoxonibate with effective antitumor activity[J].Cryst Growth Des，2014，14（1）：110-116.

[9]Zhou Z，Zhang DD，Yang L，et al.Nona-copper（Ⅱ）-con？鄄taining 18-tungsto-8-arsenate（Ⅲ） exhibits antitumor act？鄄ivity[J].Chem Commun，2013，49（1）：5189-5191.

[10]Zhang ZM，Duan XP，Yao S，et al.Cation-mediated optical resolution and anticancer activity of chiral polyoxometa？鄄lates built from entirely achiral building blocks[J].Chem Sci，2016，7（1）：4220-4229.

[11]León IE，Porro V，Astrada S，et al.Polyoxometalates as antitumor agents：bioactivity of a new polyoxometalate with copper on a human osteosarcoma model[J].Chem-Biol Int？鄄eract，2014，222（1）：87-96.

[12]翟宏菊，刘术侠，李玉新，等.K4H2.2PTi1.6W10.40O40·13H2O的合成、表征、晶体结构及抗菌活性[J].无机化学学报，2005，12（21）：1798-1803.

[13]刘杰，王恩波，计亮年.多金属氧酸盐抗病毒药物研究[J].化学进展，2006，18（1）：114-119.

[14]刘娅，谢林，刘景福，等.九钨三钛硅酸盐抗肿瘤作用及其机理研究[J].白求恩医科大学学报，1999，25（3）：241-243.

[15]Tézé A，Hervé G.α-，β-，and γ-dodecatungstosilicic acids：isomers and related lacunary compounds[J].Inorg Synth，1990，27（1）：85-96.

[16]Mitsui S，Ogata A，Yanagie H，et al.Antitumor activity of polyoxomolybdate，[NH3Pri]6[Mo7O24]·3H2O，against，human gastric cancer model[J].Biomed Pharmacother，2006， 60（7）：353-358.

[17]王恩波，胡长文，许林.多酸化学导论[M].北京：化学工业出版社，1998：17-40.

[18]谭荣欣，崔术新，王慧，等.4种含钛的多金属氧酸盐的合成及抗肿瘤活性研究[J].分子科学学报，2013，29（2）：152-155.

[19]Yamase T.Medical chemistry of polyoxometalates.Part 1.Ptent antitu-terization of novel heteropoly-tungstoarsena？鄄tes containing lanthanides 25-mor activity of polyoxomol？鄄ybdates on animal transplantable tumor and human cancer xenograft[J].Inorg Chim Acta，1988，151（1）：15-18.

（收稿日期：2017-05-24 本文編辑：祁海文）