RNA干扰血管内皮生长因子受体2基因表达提高结肠癌细胞对奥沙利铂敏感性的研究

杨平++魏建昌++陈华翠++张通++曾山崎++曹杰

[摘要] 目的 研究RNA干扰血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）基因表达对人结肠癌细胞生长的抑制作用和对奥沙利铂的化疗增敏作用。 方法 构建靶向VEGFR-2基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达质粒并转染人结肠癌细胞株SW480；通过RT-PCR和Western blot方法检测VEGFR-2 siRNA对人结肠癌细胞株SW480 VEGFR-2 mRNA和蛋白表达的影响；采用MTT实验和流式细胞术检测该siRNA及协同奥沙利铂对细胞增殖及凋亡的影响。 结果 VEGFR-2 siRNA顯著下调结肠癌细胞VEGFR-2 mRNA和蛋白的表达（P < 0.05）。VEGFR-2 siRNA协同奥沙利铂使结肠癌细胞的生长变得更加缓慢，增殖受到明显抑制，细胞抑制及凋亡明显增强（P < 0.05）。 结论 RNA干扰VEGFR-2基因表达可以抑制人结肠癌细胞株SW480的增殖，促进其凋亡，并能提高结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性。

[关键词] 结肠癌；血管内皮生长因子受体2；小分子干扰RNA；奥沙利铂

[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（b）-0016-04

Study on the sensitivity of colon cancer cells for Oxaliplatin enhanced by RNA interference in the expression of vascular endothelial growth factor receptor-2

YANG Ping WEI Jianchang CHEN Huacui ZHANG Tong ZENG Shanqi CAO Jie

Department of Gastrointestinal Surgery， Guangzhou First People's Hospital Guangzhou Digestive Diseases Center， Guangzhou First People's Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 510180， China

[Abstract] Objective To study the inhibitory effect of RNA interference in the expression of vascular endothelial growth factor receptor-2 （VEGFR-2） for the growth of human colon cancer cells and the chemosensitive effect of Oxaliplatin. Methods The expression plasmid of small interferon RNA （siRNA） targeting VEGFR-2 gene was constructed and human colon cancer cell line SW480 was transfected. The effect of VEGFR-2 siRNA for the expression of human colon cancer cells SW480 VEGFR-2 mRNA and protein was detected by RT-PCR and Western blot. The effect of siRNA or combining with Oxaliplatin for the cell proliferation and apoptosis was detected by MTT assay and flow cytometry. Results The mRNA and protein expression of VEGFR-2 were significantly down-regulated by VEGFR-2 siRNA （P < 0.05）. The combination of VEGFR-2 siRNA and Oxaliplatin could slowdown the growth of colon cancer cells， inhibit the proliferation， and significantly increase the inhibition of cell proliferation and apoptosis （P < 0.05）. Conclusion Silencing VEGFR-2 gene by the siRNA technology can inhibit the proliferation of SW480 cells， induce the apoptosis of SW480 cell， and enhance the chemotherapy sensitivity of Oxaliplatin for human colon cancer cells.

[Key words] Colon cancer； Vascular endothelial growth factor receptor-2； Small interferon RNA； Oxaliplatin

我国结直肠癌的发病率呈明显上升趋势[1]，化疗是结直肠癌综合治疗的重要组成部分，奥沙利铂是结直肠癌最常用的化疗药物之一，但肿瘤患者个体间对奥沙利铂敏感性存在着很大的差异[2]。RNA干扰技术是通过设计小分子干扰RNA（siRNA）而沉默特定基因的表达，从而提高肿瘤的化疗敏感性，在肿瘤耐药的研究中取得了一定的成效[3-4]。最近的研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR-2）所介导的信号级联通路不仅可以通过调控血管内皮细胞的增殖、迁移、存活和通透性的改变来促进血管的新生，还可通过增强肿瘤细胞的耐药性来影响肿瘤的生物学行为[5-6]。本研究旨在探讨干扰VEGFR-2基因表达对结肠癌细胞奥沙利铂敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

奥沙利铂由江苏恒瑞医药有限公司生产（批号H20000337）。SiRNA转染试剂盒siPORT Lipid Transfection Reagent购自Ambion公司。脂质体转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测盒购自Sigma公司，ImProm-Ⅱ Reverse Transcription System购自Promega公司。Annexin V-FITC apoptosis detection kit凋亡检测盒和Cycle Test TTM Plus DNA Reagent Kit细胞周期检测盒均购自美国BD公司。兔抗人VEGFR2多克隆抗体购自美国Abbiotec公司。人结肠癌SW480细胞株购自美国ATCC公司，单层的贴壁生长。

1.2 方法

1.2.1 VEGFR-2 siRNA表达质粒的构建 参照GenBank上的VEGFR-2序列（NM_002253.2），使用Ambion公司交互式软件在线设计siRNA。BLAST分析，该siRNA片段与目的基因同源，无非特异的靶序列。采用随机序列核酸（scramble）作为阴性对照，以鉴别非特异的基因抑制作用。所有siRNA由Ambion公司化学合成。VEGFR-2 siRNA序列的正义链：5'-AUUA？鄄CUUGCAGGGGACAGA-3'，反义链：5'-UAAUGAAC？鄄GUCCCCUGUCU-3'；psilencerTM质粒载体由BamH1和HindⅢ双酶切，与退火所得的双链模板DNA连接后过夜。转化感受态细菌DH5α，在含有氨苄的LB平板中进行16 h的培养后，挑取其中的阳性克隆进行细菌扩增，然后将质粒提取纯化。限制性内切酶BamH1和HindⅢ进行酶切鉴定。确认鉴定结果后，使用M13为正引物测序确认序列，-20℃保存。

1.2.2 质粒转染 取2×105个SW480细胞，种于12孔板12 h后，用Opti-MEM1培养液洗涤1次，加入1 mL的无血清DMEM。按基因转染试剂盒说明书进行转染，靶向VEGFR-2 siRNA进行稳定转染的为实验组，采用随机序列核酸scramble-siRNA作为阴性对照组，载体质粒作为空白对照组。细胞在转染48 h后，按1∶12的比例来稀释细胞进行传代和培养。另48 h后，加入G418（400 mg/mL）来筛选阳性的克隆，收集细胞进行分析。

1.2.3 RT-PCR检测VEGFR-2 mRNA表达 参照Trizol盒说明书行总RNA的抽提，后取5 μL RNA置于1.0%琼脂糖凝胶电泳，后用分光光度计测定RNA浓度以及纯度，-70℃条件下保存。取2 μL总RNA，依照说明书逆转录为cDNA。使用PCR体系：25 μL，94℃ 5 min，94℃变性45 s，51℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环，72℃延伸10 min。VEGFR-2上游引物：5'-GGAACCTCACTATCCGCAGAGT-3′，下游引物：5'-CCA？鄄AGTTCGTCTTTTCCTGGGC-3，扩增产物长度为132 bp；磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参，引物上游为5'-TCACTGCCACCCAGAAGACT-3'，下游为5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。取10 μL PCR产物电泳，紫外线照相后扫描。

1.2.4 Western blot方法确定VEGFR-2蛋白水平 提取细胞的总蛋白后，采用12%丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，10%脱脂奶粉进行封闭1 h。使用1∶100比例的山羊抗VEGFR-2多克隆抗体（购自美国Santa Cruz公司）为一抗，1∶1000比例的辣根过氧化物酶标记IgG为二抗。PVDF膜依次与一抗和二抗孵育2 h后，用发光试剂（ECL）显影，胶片曝光。

1.2.5 MTT法分析奥沙利铂敏感性 质粒转染后，取1×105个细胞/孔的SW480细胞种于96孔板，分别加入0～5 μg/mL的奥沙利铂溶液100 μL，每组设6个复孔，继续培养48 h，用MTT法在490 nm波长处测定各组细胞吸光度值，以奥沙利铂的药物浓度为横轴，细胞的存活率为纵轴，计算各组细胞的半数抑制浓度（IC50）。

1.2.6 流式细胞仪分析 实验干预48 h后收集细胞，PBS液洗后70%冷乙醇固定重新收集，PBS液洗后加入RNA酶过夜，后加入碘化丙啶（PI）染液，流式细胞仪上机，使用488 nm波长。Modfit LT 2.0软件来分析细胞周期及凋亡。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件来分析处理数据。计量资料以均数±标准差（x±s）来表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGFR-2 mRNA水平变化

转染48 h后，阴性对照组及空白对照组VEGFR-2 mRNA呈较高的表达，分别为（0.78±0.14）、（0.82±0.18），而实验组呈较低的表达（0.51±0.11），差异有统计学意义（P < 0.05）（图1）。

2.2 VEGFR-2蛋白表达的水平变化

转染48 h后，VEGFR-2-siRNA组VEGFR-2蛋白表达量较阴性对照组及空白对照组明显降低（P < 0.05）（图2）。

VEGFR-2：血管內皮细胞生长因子受体2；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶

图2 VEGFR-2蛋白表达结果

2.3 干扰VEGFR-2表达对SW480细胞奥沙利铂敏感性的影响

干扰VEGFR-2基因表达后，增加奥沙利铂干预的浓度和时间，SW480细胞的抑制率有所上升。转染48 h后，奥沙利铂作用SW480细胞的IC50为1.98 μg/mL，空白对照组IC50为5.47 μg/mL，阴性对照组IC50为5.30 μg/mL。VEGFR-2 siRNA转染后的SW480细胞对奥沙利铂的敏感性提高了约3倍。见表1。

2.4 干扰VEGFR-2表达对SW480细胞的细胞周期分布及细胞凋亡率的影响

干扰VEGFR-2基因表达，以0.4 μg/mL浓度的奥沙利铂干预48 h，流式结果示SW480细胞周期发生改变，实验组G0/G1期的比例较空白对照组、阴性对照组显著上升，G2/M期的比例较空白对照组、阴性对照组显著下降，差异均有统计学意义（P < 0.05）。此外，实验组的细胞凋亡率显著高于空白对照组和阴性对照组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。表明干扰VEGFR-2表达后，SW480细胞出现S期障碍，G0/G1的停滞期细胞分布增多，细胞的凋亡率增加。见表2。

3 讨论

VEGFR-2是一种Ⅲ型跨膜蛋白激酶，Terman等学者在1991年分离出来并报道[7]。人类VEGFR-2基因位于染色体4q11～q12，编码1356个氨基酸。VEGFR-2在血管的形成中具有重要的作用，VEGFR-2信号通路促进了一些新血管形成所需的内皮细胞响应，如细胞增殖、迁移和存活[8-9]，其异常表达和活化能促进肿瘤组织的血管生成，并引起细胞化疗耐药的产生，导致患者预后不良[10-11]。

目前结直肠癌的化疗方案主要是以铂类为基础的联合化疗。奥沙利铂是第三代的铂类化合物，干扰DNA形成链内和链间交联，抑制和减少DNA合成，发挥细胞毒和抗肿瘤的作用。奥沙利铂作为基础药物的FOLFOX、XELOX方案，是结直肠癌辅助化疗的标准[12-13]。但由于個体差异，结肠癌患者对该化疗方案敏感性差异较大，其中肿瘤患者对奥沙利铂的耐药是化疗失败的重要原因[14-15]。

siRNA技术已广泛应用于多种肿瘤耐药性逆转的研究[16-17]，利用siRNA使与肿瘤发生、发展相关基因表达下调，从而提高结肠癌耐药株的化疗敏感性，对于提高结肠癌临床疗效具有重要指导意义，也可为结肠癌耐药的逆转提供新思路[18-19]。本研究构建靶向VEGFR-2基因的siRNA表达质粒，并转染人结肠癌细胞株SW480，通过MTT和流式细胞检测发现，RNA干扰后奥沙利铂抑制肿瘤细胞增殖的作用和诱导肿瘤细胞凋亡的作用均要明显高于对照组，这说明RNA干扰VEGFR-2基因表达能够增强奥沙利铂对结肠癌细胞的杀伤作用和诱导及促进凋亡发生的作用，从而进一步抑制结肠癌细胞的生长和增殖。由此表明，VEGFR-2在结肠癌组织中的表达可能与奥沙利铂化疗耐药有关，可能是VEGFR-2使奥沙利铂等化疗药物不能通过核孔进入胞核，从而降低细胞内药物浓度，影响肿瘤细胞对化疗的敏感性[20-21]。

本研究结果显示，RNA干扰VEGFR-2基因表达可以抑制人结肠癌细胞株SW480的增殖，促进其凋亡，并能提高结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性，VEGFR-2可以成为提高奥沙利铂疗效及逆转结肠癌奥沙利铂耐药的一个新靶点，但其中具体的作用机制仍有待进一步的探索。

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（收稿日期：2017-03-23 本文編辑：张瑜杰）