小鼠胆盐依赖脂肪酶蛋白原核表达载体的构建与蛋白制备

杨奕+宋还雷+钱林溪

[摘要] 目的 构建小鼠胆盐依赖脂肪酶（BSDL）重组蛋白的大肠埃希菌原核表达载体，制备具有生物学活性的小鼠BSDL蛋白。 方法 首先应用PCR合成mBSDL的cDNA序列，克隆至原核表达载体pET-28b，转化大肠埃希菌表达菌种BL21（DE3）感受态细胞，IPTG诱导重组蛋白表达。使用His Trap FF crude柱纯化重组mBSDL蛋白。Western blot鉴定后采用尿素浓度梯度降低法进行透析复性。 结果 成功构建原核表达载体pET-28b-mBSDL，实现该蛋白在E.coli BL21（DE3）表达菌种中的高效表达，并且表达蛋白主要存在于包涵体中。Western blot示获得较好的纯化效果且纯化后成功复性。 结论 成功构建mBSDL基因的原核表达质粒并制备具有活性功能的胆盐依赖脂肪酶，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

[关键词] 重组蛋白表达；原核表达载体；mBSDL蛋白；蛋白纯化

[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（b）-0008-04

Construction of prokaryotic expression vector and preparation of mouse bile salt dependent lipase protein

YANG Yi SONG Huanlei QIAN Linxi

Xinhua Hospital Affiliated to School of Medicine of Shanghai Jiaotong University Shanghai Institute for Pediatric Research Shanghai Key Laboratory of Pediatric Gastroenterology and Nutrition， Shanghai 200092， China

[Abstract] Objective To construct a prokaryotic expression system for mBSDL in E. coli BL21 （DE3） cells and prepare the active mBSDL protein. Methods mBSDL cDNA was amplifed via PCR and inserted into the prokaryotic expression vector pET-28b. The expression of recombinant protein was induced by IPTG in E. coli BL21 cells. Then it was purified via His Trap FF crude purification system and refolded via dialysis system. The specificity of mBSDL protein was analyzed by Western blot. Results The prokaryotic expression vector pET-28b-mBSDL expressing mBSDL protein was successfully constructed and transformed into E. coli BL21（DE3） cells. The mBSDL protein was present as insoluble inclusion bodies in the bacterial extract. Western blot reveled that the purification of this recombinant protein was successful. Conclusion mBSDL protein in E. coli prokaryotic expression system is established successfully. The study provides some foundation for the further analysis of mBSDL protein.

[Key words] Recombinant protein expression； Prokaryotic expression； mBSDL protein； Protein purification

膽盐依赖脂肪酶（bile salt dependent lipase，BSDL）为脂肪酶族成员，主要存在于哺乳动物的胰液中，经合成分泌进入十二指肠，胆盐激活后联合胰腺内其他相关脂肪酶参与三酰甘油、胆固醇酯、磷脂及脂溶性维生素的消化和吸收[1]。BSDL还可见于乳腺及乳汁中，浓度为100～200 μg/mL[2]。近期研究表明，除促进消化外，还具有促进细胞增殖、抗病毒、免疫调节等作用[3-5]。BSDL蛋白的多种生理功能，对于疾病的诊断及治疗具有明显的促进作用[6-8]。目前国内少有关于BSDL蛋白的研究报道。研究BSDL蛋白在体内外的功能，获得高质量的蛋白是前提条件。本研究旨在采用分子克隆技术及大肠埃希菌原核表达系统制备具有生物学活性的小鼠BSDL蛋白。为后续课题进一步研究BSDL蛋白的生物学功能奠定实践和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株、质粒及实验动物 pET-28b载体购自Novagen公司；克隆宿主菌株E.coli Top10、表达宿主菌株E.coli BL21 （DE3）为本实验室保存。C57BL/6J雌性小鼠由上海交通大学医学院附属新华医院动物实验中心提供。动物合格证号：SYXK（沪）2003-0031。

1.1.2 试剂 EcoR I、Nde I 限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、逆转录酶、dNTP、辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG购自上海碧云天生物技术有限公司；抗BSDL抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；卡那霉素、IPTG、DNA marker、BCA蛋白质量浓度测定试剂盒购自上海鼎国生物技术有限公司；protein marker、TRIzol RNA提取试剂、ECL化学发光试剂购自美国Thermo Scientific公司；PCR产物胶纯化回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；其他生化试剂均为国产分析纯产品。

1.2 实验方法

1.2.1 pET-28b-mBSDL原核表达载体的构建与鉴定 根据小鼠BSDL基因的DNA序列，设计一对扩增引物，上游引物为5'-CGCCATATGGCAAAGTTGGGGG？鄄CTG-3'，下游引物为5'-ATAGAATTC TTAGAAGCCA？鄄ATGGTGG-3'。在引物两端分别插入EcoR I和Nde I的酶切位点和保护碱基。取10日龄雌性C57BL/6J小鼠乳腺组织100～200 mg，TRIzol试剂提取總RNA，反转录合成cDNA第一条链。以2 μL反转录产物为模板，进行PCR反应。结束后扩增产物进行1% 琼脂糖电泳（100 V，30 min），胶回收扩增目的基因片段后，用EcoR I和Nde I双酶切PCR产物和pET-28b空载体。酶切产物进行电泳，回收目的片段和质粒大片段用T4连接酶4℃连接过夜。连接产物转化至Top10感受态细胞，加LB培养基，复苏培养1.5 h后，离心。将菌体沉淀均匀涂布至含有100 μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养皿中。倒置于37℃培养箱中过夜，次日自培养皿挑取单菌落接种到加入卡那霉素的LB液体培养基中，扩大培养4 h后，取2 μL菌液进行PCR鉴定。收集细菌提取质粒，双酶切鉴定后，将含目的片段的质粒DNA送上海生工公司测序。

1.2.2 重组mBSDL蛋白的原核表达 用CaCl2法制备E.coli BL21（DE3）表达菌种的感受态细胞，将测序正确的重组质粒转化到感受态细胞，涂布于含有100 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，电泳筛选阳性表达株。挑取阳性单克隆扩大培养。扩大培养后取40 mL菌液接种于4 L表达培养基（含100 μg/mL卡那霉素），37℃、200 r/min条件下振荡培养2～3h，OD600达到0.4～0.6后，加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5～1 mmol/L，继续振荡培养3～5 h。诱导前后各取1 mL菌液，离心沉淀进行SDS-PAGE分析。收集表达产物，离心后采用酶解和超声结合的方法进行菌体裂解。冰浴下超声破菌，离心后取上清、沉淀进行SDS-PAGE 分析，确定目的蛋白是否表达。

1.2.3 重组mBSDL蛋白包涵体的处理 菌体沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20～30 min，于4℃，12000 r/min离心15 min，弃去上清液。重复一次。再用适量的50 mmol/L Tris pH 8.0溶液洗涤一遍，以去除残留的EDTA。之后于4℃ 12 000 r/min离心15 min，弃去上清液。沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬后，室温5～6 h直至大部分溶解。离心收集上清液。

1.2.4 重组mBSDL的纯化和Western blot鉴定 使用His Trap FF crude 柱纯化重组mBSDL蛋白。平衡柱后用1 mL注射器将澄清的包涵体溶液注入流路，流速≤1 mL/min。在上样过程中，连续不断地搅拌样品以防止沉淀。用10～15个柱床体积的结合缓冲液冲洗，直到吸收曲线稳定在基线。洗脱时用含50、100、500 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液分部洗脱。分部洗脱时，洗脱5个柱床体积，每个浓度咪唑收集2个柱床体积洗脱液，并进行SDS-PAGE检测。

纯化后蛋白进行Western blot分析。一抗用抗BSDL抗体，二抗用辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体。TBST洗涤后，将ECL发光液均匀铺在条带正面，覆盖保鲜膜，放入美国Bio-Rad公司ChemiDoc XRS仪器中收集信号。

1.2.5 重组mBSDL蛋白纯化后复性与酶活测定 采用尿素浓度梯度降低法进行透析复性。将洗脱液置于透析袋内，采用7 mol/L的尿素溶液作为起始透析液，每4～8小时逐渐稀释降低透析外液中的尿素浓度，依次为6、5、4、3、2、1、0 mol/L。透析液中加入0.5 mol/L甘氨酸、10%甘油、0.4～1.0 mol/L Tris等重折叠介质。采用速率法计算酶活性。双蒸水调零，Nanodrop 2000分光光度计测量纯化后蛋白样品的OD405值，根据标准曲线方程计算得出酶活性。BSDL酶活性单位定义为：37℃，pH 7.5条件下，每分钟催化1 pmol底物的脂肪酶的酶量为一个酶活性单位。

2 结果

2.1 mBSDL基因扩增鉴定

mBSDL基因PCR扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，在预期位置出现约为1797 bp的单一条带，与预期值相符。见图1。

2.2 成功构建mBSDL蛋白的原核表达载体

重组表达质粒pET-28b-mBSDL双酶切后形成两条DNA片段，一条为原核表达载体片段，另一条为目的产物片段，与预期结果相符（图2）。测序验证正确，与NCBI 数据库提供的序列相似度为99.66%（图3），成功构建pET-28b-mBSDL重粒。

2.3 成功诱导mBSDL蛋白表达

将原核表达载体pET-28b-mBSDL 转化大肠埃希菌表达菌种BL21（DE3）感受态细胞，菌落PCR，凝胶电泳结果示：多个单克隆均为阳性，单克隆1、单克隆2和单克隆3均获得较大量的表达（图4）。单克隆扩大培养后，应用IPTG诱导蛋白表达，对蛋白表达产物进行SDS-PAGE 蛋白变性电泳分析。结果发现，与未诱导组相比，IPTG 诱导后出现明显的高表达蛋白条带，且与预期蛋白的大小相符（67kD）。细菌总蛋白、诱导后细菌裂解上清液及细菌包涵体蛋白的SDS-PAGE电泳提示，重组mBSDL蛋白主要存在于包涵体中（图5）。

2.4 重組mBSDL蛋白的纯化复性

Western blot分析结果示纯化后杂蛋白去除。根据蛋白质标准判断，目的蛋白相对分子质量略小于70 kD，为67 kD，与预期蛋白大小相符（图6）。应用凝胶成像分析系统计算目的条带的灰度值，目的蛋白纯度约为98%。随后对复性的mBSDL进行测活，活性达到5.268 U/mL（30 s），5.358 U/mL（60 s）。

3 讨论

分子克隆技术和原核表达系统是蛋白表达和生物合成最常用的方法[9]。本研究采用小鼠乳腺组织总RNA为模板，通过RT-PCR成功扩增出mBSDL基因编码区全长序列，定向插入pET-28b载体中，双酶切和测序均证实该重组质粒的正确性。成功构建了pET-28b-mBSDL原核表达载体，该研究所采用的pET表达系统利用T7启动子，融合6个组氨酸便于蛋白质纯化，操作相对方便、快捷、需时较短，表达量大，仅需读框正确即可[10]。IPTG诱导目的蛋白高表达后，分别提取细菌总蛋白，上清可溶蛋白和胞质不可溶蛋白进行分析，结果发现重组蛋白主要存在于包涵体中。

包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠埃希菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，0.1～3.0 μm大小[11]。包涵体中的表达产物占总蛋白的50%以上[11-12]。因包涵体内还含有其他非表达产物如宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、脂类及糖类等物质，所以需要进行重组蛋白质的纯化。本实验使用His Trap FF crude 柱，不同浓度咪唑分部洗脱非特异性结合蛋白，进行重组mBSDL蛋白纯化并进行Western blot分析鉴定，最终获得纯度约为98%的mBSDL蛋白。细胞中功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。但由于包涵体在形成过程中，多肽浓度较高，无充足时间进行折叠，导致包涵体内的蛋白是非折叠状态、无定形的聚集体，不具有生物学活性[13]。因此，纯化后必须人工复性，以恢复表达蛋白的天然构象和生物学活性。本实验采用连续尿素浓度梯度降低法进行透析复性处理。尿素浓度从7～0 mol/L缓慢降低，酶活测定提示该蛋白成功再折叠。此方法操作简单，成本低，可行性大，是mBSDL蛋白可靠且有效的复性方法。BSDL蛋白N末端域为胆汁盐结合、催化和N-糖基化的部位[14]。BSDL的水解活性是由丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸催化三联体形成的[15]。BSDL的N-糖基化位点为第187位天冬酰胺[16]。研究表明，该糖基化作用改变多肽的构象，增加了BSDL蛋白的稳定性，且这一作用对其活性尚无明显影响[16]。

本研究成功构建了小鼠BSDL基因的原核表达质粒，并对该基因的原核表达产物进行鉴定分析，成功表达出具有活性功能的重组mBSDL蛋白。这为下一步mBSDL蛋白的生物学功能研究奠定了基础。

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（收稿日期：2017-04-12 本文编辑：苏畅）