热休克蛋白A12B对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用

戴乐杨 孔秋月 李楠 丁正年

热休克蛋白A12B对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用

戴乐杨 孔秋月 李楠 丁正年

目的 探讨热休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)在心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤中的作用。 方法 本实验采用8～10周龄、雄性高表达HSPA12B转基因鼠(HSPA12B transgenic mice,Tg鼠),一窝所生的雄性野生型(wild type,WT)鼠作为对照,随机分配后行假手术或I/R手术，结扎冠状动脉左前降支45 min (缺血)、松开结扎线4 h (再灌注)。 通过聚合酶链式反应(PCR)检测WT鼠I/R手术与假手术后4 h,心肌HSPA12B mRNA的表达水平;通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定I/R手术后4 h,WT鼠与Tg鼠的心肌梗死面积;通过免疫印迹法检测WT鼠与Tg鼠分别行I/R手术与假手术的4组心肌中Bcl-2和Bax蛋白水平。 结果 I/R损伤引起WT鼠心肌HSPA12B mRNA表达水平增高。在共同经历I/R损伤后,Tg鼠较WT鼠的心肌梗死面积缩小,并且Tg鼠心肌组织抗凋亡能力(Bcl-2/Bax比值)明显高于WT鼠。 结论 高表达HSPA12B可能通过减少细胞凋亡,减轻心肌I/R损伤,发挥心肌保护的功能,提示HSPA12B可能是干预心肌I/R损伤的潜在靶点。

热休克蛋白A12B; 心肌缺血/再灌注损伤; 细胞凋亡

心肌缺血是临床常见疾病,尽早恢复缺血心肌的血流是治疗心肌缺血的根本手段[1]。然而,在血流恢复的早期会额外加重原有缺血心肌的损伤,这种现象被称为缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。热休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)是近年在动脉粥样斑块中克隆到的新型热休克蛋白[2],课题组前期研究发现HSPA12B能够减轻脑I/R损伤[3],并对永久缺血诱发的心脏重塑有保护作用[4],但HSPA12B在心肌I/R损伤中的作用尚不清楚,本研究将探讨HSPA12B是否对心肌I/R损伤具有保护作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 采用BAC/PAC系统,构建人HSPA12B基因的表达载体。限制性内切酶酶切后获得线性化的人HSPA12B基因表达序列,显微注射到C57BL/6小鼠受精卵原核中。通过提取鼠尾基因并与转基因特异性引物进行PCR来确定首建鼠的基因型。首建鼠与所有的后代均与C57/BL6小鼠回交。通过免疫印迹法验证高表达HSPA12B小鼠转基因成功[5]。本实验采用8～10周龄、雄性高表达HSPA12B的转基因鼠(HSPA12B transgenic mice,Tg鼠),一窝所生的雄性野生型(wild type,WT)鼠作为对照。实验动物饲养于南京大学模式动物研究所SPF级动物房。

1.2 方法

1.2.1 心肌I/R模型:小鼠1.5%～2%异氟烷吸入麻醉后,开胸、暴露心脏,结扎冠脉左前降支引起心肌缺血,45 min后解除结扎进行血流再灌注。假手术(Sham)组除不结扎血管外,其他步骤与I/R手术一致[6]。

1.2.2 定量聚合酶链反应(PCR):收集I/R术后4 h的心室肌组织,提取总RNA,逆转录合成cDNA,以HSPA12B相应引物进行定量PCR,其上游、下游引物分别为GGCCTGCAAGGGCTGTATATC、ATGTGGTTCCAAAGTCGATGG。检测心肌组织中HSPA12B mRNA的表达水平。

1.2.3 免疫印迹:收集I/R术后4 h的心室肌组织,提取可溶性蛋白质,先行10%SDS-PAGE胶分离蛋白，再转至PVDF膜(Millipore)上,5%脱脂牛奶封闭1 h,抗HSPA12B(1∶1000,Santa Cruz,美国)、抗Bax(1∶1000,Cell Signaling Technology,美国)、抗Bcl-2(1:1000,Cell Signaling Technology,美国)抗体孵育过夜(4 ℃),继而用辣根过氧化物酶标记二抗4 ℃孵育2 h,ECL(Pierce,美国)显色。以抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(1∶1000,Bioworld,美国)的免疫印迹作为上样量的内参[4]。显色条带用AlphaEaseFC(Alpha Innotech,美国)进行灰度定量。检测HSPA12B、Bax、Bcl-2的蛋白水平。

1.2.4 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色:I/R术后4 h,断颈处死小鼠,快速取出心脏,生理盐水漂洗血液后切片,置于1.5%的TTC溶液中37℃孵育15 min。检测梗死面积(白色)占心室面积的百分比,以此表示心肌损伤的程度。

1.3 统计学分析 所有数据采用GraphPad Prism 6进行统计分析,结果以均数±标准差表示,2组间比较采用成组t检验,多组间比较采用双因素方差分析(two-way ANOVA),组间多重比较采用Tukey检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 I/R损伤对WT小鼠心肌HSPA12B mRNA表达的影响 与WT小鼠Sham组相比,I/R组的小鼠心肌组织中HSPA12B mRNA水平增高了157.8%(0.9±0.2比0.4±0.1,P<0.01,n=6)。

2.2 鉴定HSPA12B转基因小鼠 与WT鼠相比,Tg鼠心肌组织HSPA12B蛋白水平升高了591.4%(6.9±0.5比1.0±0.1,P<0.01,n=4)。表明转基因鼠构建成功。见图1。

图1 Tg鼠和WT鼠心肌HSPA12B蛋白水平比较

2.3 HSPA12B缩小I/R损伤引起的心肌梗死面积 I/R 4 h后,与WT鼠相比,Tg鼠的心肌梗死面积缩小了52.3%(14.4%±1.5%比30.3%±4.4%,P<0.01，n=5)。该结果提示,高表达HSPA12B可以显著减轻心肌I/R损伤。见图2。

图2 I/R 4 h后Tg鼠与WT鼠心肌梗死面积比较

2.4 HSPA12B使I/R损伤心肌抗凋亡蛋白水平升高 WT、Tg小鼠的Sham亚组之间Bcl-2/Bax比值的差异没有统计学意义(1.0±0.1比1.0±0.1,P>0.05,n=4)。与WT、Tg小鼠组的Sham亚组相比,对应的I/R亚组Bcl-2/Bax比值分别增加了73.1%、259.0%(P<0.01)。与WT小鼠I/R亚组相比,Tg小鼠I/R亚组Bcl-2/Bax比值升高了103.1%(P<0.01)。见图3。

图3 4个亚组间小鼠心肌Bcl-2/Bax比值比较

3 讨论

冠脉血管阻塞后,其负责供血的心肌区域被称为缺血风险区。无血流时间达到一定长度,缺血风险区会出现坏死、凋亡,表现为心肌梗死、心功能下降。及早恢复血液灌注是挽救缺血心肌重要的治疗手段[7]。然而,大量临床资料和动物实验表明,I/R损伤可能进一步扩大心肌梗死面积、损害心功能，甚至导致心律失常[8]。因此,如何减轻心肌I/R损伤,是一个严峻且亟待解决的临床问题。在本实验中,我们发现HSPA12B过表达的Tg小鼠经历I/R损伤后呈现的心肌梗死面积较WT鼠减少了50%以上。结果提示,HSPA12B能显著减轻心肌I/R损伤,具有心脏保护作用。

心肌I/R损伤与心肌梗死的病理表现并不完全相同,前者表现为凋亡相关的介质增多(激活的caspase-3和细胞色素c),后者则表现为更加明显的炎症反应,血浆促炎因子白细胞介素6水平增高以及中性粒细胞在梗死相关区域渗透聚集。据此认为I/R主要与凋亡相关[9]。细胞凋亡主要通过三种方式进行,外源性死亡受体途径、内源性线粒体途径和内源性内质网应激途径[10]。在内源性线粒体途径中,Bax和Bcl-2参与细胞色素c的调释放节,其中前凋亡蛋白Bax促进(抗凋亡蛋白Bcl-2抑制)细胞色素c的释放,形成凋亡体,激活下游的caspase-3,最终导致凋亡的产生[11-12]。因此,有学者提出Bcl-2/Bax决定了细胞的命运[13]。我们曾经报道,高表达HSPA12B可以减轻脑I/R损伤后的神经元凋亡[3]。在本实验中,我们发现在心脏经历I/R损伤后,Tg鼠的Bcl-2/Bax比值比WT鼠升高了1倍。据此,我们推测,过表达HSPA12B增加了I/R损伤后Bcl-2/Bax的比值,发挥了抑制凋亡的作用,增加心肌细胞生存机会,从而保护心肌,减轻I/R损伤。

此外,HSPA12B还具有改善内皮细胞通透性[14]和下调炎症粘附因子及炎症因子的作用[15],而氧化应激引起的炎症级联放大反应则是心脏I/R损伤另外一种重要的机制[9]。在下一步研究中,我们将会继续探索HSPA12B在心脏I/R损伤中是否具有调节血管通透性及炎症反应的生物学作用。

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Protective effects of heat shock protein A12B on myocardial ischemia/reperfusion injury in mice

DAILe-yang,KONGQiu-yue,LINan,DINGZheng-nian.
DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

Objective To investigate the effect of heat shock protein A12B(HSPA12B) on myocardial ischemia/reperfusion injury in mice. Methods Male littermates of transgenic mice (Tg) with over expression of HSPA12B and wild type (WT) mice as the control aged 8-10 weeks were enrolled in the experiments. The mice were randomly devided into sham operation group and myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury group.The mice in I/R group

the intervention that left anterior descending (LAD) coronary artery was legated for 45 min (ischemia) and then the blood flow was restored for 4 h (reperfusion). The mRNA level of HSPA12B was measured by real time-PCR; the myocardial infarction size was determined by TTC staining; And the expression of Bcl-2 and Bax were detected by immunoblot. Results I/R injury could induce the increase of the mRNA level of HSPA12B in WT mice. After I/R injury, the infarction area of Tg mice was smaller than that of WT mice, and the myocardial anti-apoptosis ability (the ratio of Bcl-2/Bax) of Tg mice was better than that of WT mice. Conclusions The over expression of HSPA12B can protect heart from I/R injury in mice through reducing the cell apoptosis and might be the potential target to the intervention of myocardial I/R injury.

heat shock protein; myocardial ischemia/reperfusion injury; apoptosis

210029江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院麻醉科

丁正年，Email：zhengnianding@njmu.edu.cn

R 542.2

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.08.008

2016-11-08)