微生物法测定米粉中维生素B6含量不确定度评估

熊 娟，蔡大川*，张燕忠，陈敏儿，黄璇莹

(1.中国广州分析测试中心， 广东省化学危害应急检测技术重点实验室 510070； 2.广东省汕头市潮汕工夫茶研究所)

微生物法测定米粉中维生素B6含量不确定度评估

熊 娟1，蔡大川1*，张燕忠2，陈敏儿1，黄璇莹1

(1.中国广州分析测试中心， 广东省化学危害应急检测技术重点实验室 510070； 2.广东省汕头市潮汕工夫茶研究所)

应用微生物法测定米粉样品中维生素B6含量，并从多个方面分析测量的不确定度。试验结果表明：相对合成标准不确定度为0.01393，扩展不确定度为0.1653，测量结果为(5.932±0.1653) μg/hg；影响维生素B6测定结果的最主要不确定度分量为微量移液枪容差。

微生物法；维生素B6；不确定度；评估

维生素B6是婴幼儿米粉中的重要营养物质，国家标准中有严格的限量，但由于其含量较低，常用的高效液相法、气相色谱法等由于检出限较高，难以准确测量其含量，微生物法因其灵敏度高，被国家标准纳入国家仲裁测定法。但微生物法操作繁琐、菌株生长不确定性强，使得测定结果受多种因素的影响，最新版国家标准GB 5009.154-2016《食品安全国家标准 食品中维生素B6的测定》中第二法规定试验室可采用商品化的试剂盒替代传统标准曲线制定，以减少试验中的标准误差[1]。

商品试剂盒性质稳定，但是测量过程中还是会不可避免地产生不确定度[2-4]。因此，不确定度的测量也越来越被大家所重视[5-7]。本文根据食品安全国家标准GB 5009.154-2016，采用微生物法测定米粉样品中维生素B6含量，分析试验过程中各种影响因素，并根据《化学分析中不确定度的评估指南》CNAS—GL06对不确定的来源进行分析和计算，得出扩展不确定度[8]。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

VitaFast@Vitamin B6检测试剂盒，购于拜发分析系统销售(北京)有限公司，用于定量检测食品、药品和动物饲料中的维生素B6含量；SHP-250型生化培养箱，购于广东环凯微生物科技有限公司，广泛用于培养试验等；Thermo酶标检测仪MK3，购于赛默飞世尔(上海)仪器有限公司，用于测量板孔吸光度值。

1.2 试验方法

称取2.5 g均质米粉样品放入250 mL 锥形瓶中，加入50 mL pH值为4.5的柠檬酸盐缓冲液，摇匀。加入25 mg马铃薯酸性磷酸酶，摇匀。37℃暗处孵育1 h，不时振荡。精确加入蒸馏水100 mL，摇匀。95℃水浴提取30 min，其间振荡至少5次，确保离心管紧闭。迅速冷却到 30℃以下。离心后根据浓度范围，确定是否在2 mL无菌小试管中进一步稀释上清液。

加入10 mL无菌水至试剂盒中维生素B6培养基瓶中，拧紧培养基瓶，摇匀。95℃加热5 min，其间振荡至少2次，迅速冷却至室温。使用0.2 μm无菌滤膜过滤培养基至无菌离心管中。

取6个无菌管，按照试剂盒说明书准备以下浓度标准品溶液：0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.012 mg/hg。样品提取稀释倍数1∶40已经包含在标准曲线中。

取出需要数量的微孔板条并在板上固定，移取150 μL培养基至各微孔中，然后移取150 μL各标准品或稀释的样品至指定的微孔中。封闭微孔板条后在30℃条件下暗处孵育44～48 h，用酶标仪在630 nm条件下读取吸光度。

1.3 数学模型

米粉中维生素B6(μg/hg)含量按下式计算：

维生素B6(X)=样品在标准曲线读取的浓度(C)×稀释倍数(n)×0.822/样品量(m)

则X的相对标准不确定度为：

1.4 不确定度分量评定

(1)影响样品在标准曲线读取的维生素B6浓度(C)测定的不确定度分量包括：标准品纯度引入的不确定度、微量移液器自身容差引入的不确定度、样品培养液吸光度值的不确定度、样品测定重复性的不确定度。

(2)影响样品称量结果(m)不确定度的分量为天平自身精密度。

(3)影响样品稀释(n)定容的不确定度分量包括：移液器及容量瓶自身容差引入的不确定度、试验环境温度变化引入的不确定度。

2 结果与分析

2.1 样品维生素B6含量测定引入的不确定度

2.1.2 微量移液器的不确定度 根据JJG 646-2006规定，20℃时20～200 μL量程的测量范围内最大允许差为±3.0 μL，取均匀分布，则由此带来的不确定度为：

该移液器在本试验中的加样体积为150 μL，其相对标准不确定度为：

2.1.3 样品培养液吸光度值的不确定度 样品培养液吸光度值的不确定度由重复测定所得吸光度值的标准差决定，将最终样品溶液平行培养12管，测定每管培养液的吸光度值，结果如表1所示。

表1 样品培养液吸光度值重复测定结果

根据贝塞尔公式计算由随机效应导致的标准不确定度：

相对标准不确定度：

2.1.4 测定重复性的不确定度 在重复性条件下，对该样品进行12次独立测量(n=12)，结果如表2。

表2 低聚糖重复测定结果

根据贝塞尔公式计算由随机效应导致的标准不确定度：

相对标准不确定度计算公式为：

样品维生素B6浓度测定引入的相对标准不确定度为：

称取样品使用的电子天平精密度为0.001 g，根据天平检定证书，其最大允许误差为±0.001 g。本试验中使用减法称取样品2.500 g，共称重2 次，即空盘质量和总质量，天平线性按矩形分布计算，样品称重的不确定度：

相对标准不确定度

2.3 样品稀释定容引入的不确定度

2.3.2 温度变化引起的不确定度 假设温差为±15℃，则由此导致的体积V的分散区间半宽度为：△V=100×2.1×10-4×15=0.32 mL，按均匀分布，则由温度变化引入的不确定度为：

由100 mL容量瓶引入的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

样品稀释定容引入的相对标准不确定度为：

2.4 维生素B6测定的不确定度分量

表3 维生素B6含量测定的不确定度分量

2.5 扩展不确定度及测定结果

U(x)=kUrel(x)X=2×0.01393×5.932=0.1653

米粉中维生素B6含量为：

X=(5.932±0.1653)μg/hg (k=2)

3 结论

本试验采用微生物法测定米粉样品中维生素B6的含量，结果为(5.932±0.1653) μg/hg，k=2。由于本试验采用商品化的试剂盒，在接种菌种数量、菌种活力等方面无法测定其不确定度，所以在标准曲线读取的维生素B6浓度(C)、样品称量结果(m)、样品稀释(n)定容等几个方面进行不确定度评定，结果表明：不确定度的主要来源样品在标准曲线读取的维生素B6浓度测定，其中最主要来自微量移液器容差的不确定度。所以在试验过程中应注意尽量减小微量液体转移的偏差，注意对微量移液器进行定期维护和校准。

[1]张艳,王甲威,赵相霞.微生物法测定维生素的质量控制[J].中国乳品工业,2014,42(8):54-57.

[2]国家质量监督检验检疫总局.JJF1059-1999 测量不确定度评定与表示[S].北京：中国计量出版社，1999.

[3]李慎安.化学试验室测量不确定度[M].北京：化学工业出版社，2006.

[4]国家质量技术监督局计量司组.测量不确定度评定与表示指南[M].北京：中国计量出版社，2000.

[5]郝晓莉,赵瑛博,陈芳芳.分光光度法测定白菜中亚硝酸盐的不确定度评定[J].食品科学,2013,34(6):208-210.

[6]牛华,牛之瑞,冯雷.高效液相色谱法测定辣椒粉中罗丹明B的测量不确定度评估[J].食品科学,2014,35(8):165-168.

[7]王吉祥,张学忠,王亚.气相色谱法和气相色谱-质谱法测定茶叶中联苯菊酯的不确定度评定[J].食品科学,2014,35(12):200-203.

[8]国家质量监督检验检疫总局.JJF1059.1 2012 测量不确定度评定与表示[S].北京:中国计量出版社,2012.

(责任编辑：刘新永)

《福建农业科技》版权声明

凡向本刊投稿者，如无特殊声明，稿件一经采用，其专有出版权和网络传播权即授予本刊，并许可本刊在本刊网站或本刊授权的网站上传播。作者稿酬和著作权使用费在刊发后一次性支付。对于上述合作条件若有异议，烦请来稿时声明，本刊将适当处理；未作声明者，本刊将视为同意。同时，要求投寄给本刊的稿件(论文、图表、照片等) 没有侵犯他人著作权或其他权利的内容，并且文责自负。谢谢合作，并致诚挚敬意。

Uncertainty evaluation in determination of vitamin B6 in rice flour by microbiological method

XIONG Juan1， CAI Da-chuan1*， ZHANG Yan-zhong2， CHEN Min-er1， HUANG Xuan-ying1

(1.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofEmergencyTestforDangerousChemicals,ChinaNationalAnalyticalCenter510070； 2.InstituteofChaoshanKungfuTeainShantou)

In this paper, the content of vitamin B6 in rice flour samples was determined by microbiological method, and the uncertainty of measurement was analyzed from several aspects. The results showed that, the relative synthetic standard uncertainty was 0.01393, the expanded uncertainty was 0.1653, and the result was ( 5.932 0.1653 ) μg/100 g. The main uncertainty component affecting the determination results of vitamin B6 is the capacity difference within micro pipette tips.

Microbial method; vitamin B6; uncertainty; assessment

2017-04-10

熊娟，女，1985年生，助理研究员。

*通讯作者：蔡大川，男，1973年生，高级工程师 (E-mail：cai-dachuan@21cn.com)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2017.04.007