松龄血脉康胶囊对自发性高血压大鼠高血压相关基因表达的影响

施伟丽,王 燕,信琪琪,徐 磊,滕传震,陈可冀△,丛伟红

(1.中国中医科学院西苑医院，北京 100091；2.北京中医药大学，北京 100029；3.成都康弘制药有限公司，成都 610036)

【实验研究】

松龄血脉康胶囊对自发性高血压大鼠高血压相关基因表达的影响

施伟丽1,王 燕2△,信琪琪1,徐 磊3,滕传震3,陈可冀1△,丛伟红1

(1.中国中医科学院西苑医院，北京 100091；2.北京中医药大学，北京 100029；3.成都康弘制药有限公司，成都 610036)

目的：:探讨松龄血脉康对自发性高血压大鼠血压的干预作用及机制。方法：自发性高血压大鼠随机分组后，分别灌胃给予松龄血脉康和氯沙坦钾，连续给药9周，每周检测收缩压、舒张压变化。以HE染色观察药物对大鼠主动脉病理组织形态学影响，qPCR阵列技术检测高血压相关因子RNA水平的变化，继而借助String及KEGG Pathway数据库对差异基因进行网络分析。结果：给药9周后，与模型组比较高剂量松龄血脉康组及氯沙坦钾组大鼠的收缩压、舒张压均显著降低；高剂量松龄血脉康组大鼠血浆中血管紧张素Ⅱ水平较模型组明显降低，且与氯沙坦组比较特别显著性降低；对qPCR筛选得到的12个差异表达基因进行网络分析发现，Pde5a、Prkg1、Gucy1b3和Prkg2相互作用明显，且均参与cGMP-PKG通路的活化。结论：松龄血脉康降低自发性高血压大鼠血压，其机制可能与降低大鼠血浆中AngⅡ水平、调控差异表达基因Pde5a、Prkg1、Gucy1b3和Prkg2共同参与的cGMP-PKG通路有关。

松龄血脉康；高血压；qPCR阵列检测

高血压病是以血压升高为主要临床特征的综合征，迄今依旧是心血管疾病死亡的重要原因之一。松龄血脉康胶囊由葛根、鲜松叶、珍珠层粉组成，具有平肝潜阳、镇心安神的功效，临床用于高血压、高血脂的治疗，并取得了一定疗效[1-2]。已有研究发现，松龄血脉康可降低自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)血浆中血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、醛固酮含量及肝脏血管紧张素转换酶、血管紧张素Ⅱ一型受体mRNA的表达水平，提示松龄血脉康可能通过影响肾素-血管紧张素-醛固酮水平调控血压[3]；也有研究显示，松龄血脉康可能通过激活PI3K/Akt信号通路，维持自发性高血压大鼠心脏正常的收缩和舒张功能[4]。但目前有关松龄血脉康降压作用分子机制的研究尚不深入。本文以qPCR阵列技术对高血压相关基因进行筛选研究，以期为阐明松龄血脉康降压作用的分子机制和临床应用提供更多的可靠依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级9周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)40只，9周龄雄性wistar kyoto大鼠(WKY)10只，购自北京维通利华实验动物有限公司(合格证书号SYXK(京)2012-0012)，饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级动物房，自由取食及饮水，12 h明暗交替控制(光照时间8∶00-20∶00)。

1.2 实验药物及试剂

氯沙坦钾片由杭州默沙东制药有限公司提供(批号L016172),松龄血康胶囊由成都康弘有限公司提供(批号160216)，药物组成成分：鲜松叶、葛根、珍珠层粉；RNA提取试剂盒(Roche：11667165001)，All-in-OneTMFirst-Strand cDNA 合成试剂盒(GeneCopoeia：AORT-0050)，All-in-OneTM qPCR Mix(GeneCopoeia：AOPR-0200)，All-in-OneTM qPCR引物(GeneCopoeia)。

1.3 实验仪器

智能无创鼠尾压测量仪(日本BP98AWU)，全自动生化分析仪(日本日立公司7600)，脱水机(武汉俊杰电子有限公司JJ-12J)，包埋机(武汉俊杰电子有限公司JB-P5)，病理切片机(上海徕卡仪器有限公司RM2016)，冻台(武汉俊杰电子有限公司JB-L5)，组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司KD-P)，烤箱(上海慧泰仪器制造有限公司DHG-9140A)，正置光学显微镜(日本尼康ECLIPSE CI)，成像系统(日本尼康DS-U3)，NanoDrop© Lite紫外分光光度计(美国赛默飞)，LightCycler480 PCR仪(美国罗氏)。

2 方法

2.1 分组及给药方法

40只9周龄雄性SHR大鼠适应性饲养1周后，随机分为模型组、氯沙坦钾组、高剂量和常规剂量松龄血脉康组4组各10只，以WKY大鼠为正常对照组。氯沙坦钾片研磨后按每天31.5 mg·kg-1灌胃给药，高剂量松龄血脉康组以每天1 g·kg-1灌胃，常规剂量松龄血脉康组以每天0.5 g·kg-1灌胃，模型组及正常对照组给予等体积生理盐水，给药9周。

2.2 血压测定与样本采集

每周检测大鼠尾动脉血压，每次检测重复3次取其平均值；腹主动脉采血，西苑医院检验科检测大鼠血浆中AngⅡ水平；取材胸主动脉用于HE染色及qPCR阵列检测。

2.3 病理组织学检测

胸主动脉用福尔马林固定、石腊包埋、切片后用HE染色，观察主动脉病理形态变化。

2.4 qPCR阵列检测

提取组织RNA后用All-in-OneTMfirst-strand cDNA synthesis kit 将RNA逆转录为cDNA；混合cDNA模板和All-in-OneTMqPCR mix，将混合液滴入孔中；在Real-time PCR仪中进行反应；运用GeneCopoeia的网上数据分析工具分析数据。

2.5 所得差异基因的网络分析

结合String(http://www.string-db.org)和KEGG Pathway(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)数据库对所得基因进行网络分析。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 松龄血脉康对自发性高血压大鼠血压的影响

松龄血脉康对自发性高血压大鼠收缩压的影响 表1显示，给药1周后氯沙坦钾组收缩压、舒张压较模型组显著性降低(P<0.01)；5周后高剂量松龄血脉康组收缩压、舒张压逐渐降低，且较模型组降低明显(P<0.05)；给药9周后氯沙坦钾组、高剂量松龄血脉康组收缩压、舒张压较模型组均显著下降，且高剂量松龄血脉康收缩压与氯沙坦钾组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

组 别鼠数0周1周2周3周4周5周6周7周8周9周对照组10SBP98.38±13.95110.74±18.32112.52±17.99114.29±9.79110.37±9.75119.78±10.08106.21±17.02107.58±12.78109.27±13.78109.94±14.48DBP65.96±8.569.58±18.370.29±20.9475.21±6.3374.53±11.2177.08±13.3170.46±12.9572.92±9.5171.69±12.176±12.42模型组10SBP136.1±15.01**147.55±9.26**150.84±8.69**157.56±7.26**156.26±10.11**161.06±5.91**158.4±5.4**161.27±7.56**163.24±3.95**164.61±6.55**DBP104.62±14.43**105.49±10.65**109.1±11.49**115.87±10.75**109.13±15.35**118.82±14.88**113.4±11.81**118.73±9.85**120.47±10.26**117.21±15.06**氯沙坦钾组10SBP140.27±6.46127.25±12.16△△144.73±10.13141.76±13.64△△142.83±11.43△△136.17±16.27△△143.13±9.75△148.61±10.97△△145.01±13.22△△144.9±16.27△△DBP108.46±9.7983.06±14.9△△102.91±8.37102.59±16.72△△104.07±8.4898.05±15.85△△101.73±19.87106.18±12.78△△100.02±13.27△△103.26±14.93△△松龄血脉康高剂量组10SBP143.11±10.82141.69±12.88##149.46±12.77147.38±10.43△151.64±13.88#149.23±12.67△140.33±21.57△150.36±6.86△△148.48±10.5△△149.99±13.31△△DBP101.09±10.57100.33±18.01##104.02±13.11104.01±15.73△109.98±20.84105.85±15.27△99.33±20.64△108.27±9.55△106.67±14.22△△107.86±17.31△松龄血脉康常规剂量组10SBP130.31±18.52139.09±13.76#151.29±7.09148.52±13.61△155.61±10.71##145.84±14.54△△140.29±20.32△151.95±14.15△153.6±12.44△154.24±9.27△#DBP100.85±11.6994.24±13.01△#107.51±7.99103.11±12.51△△114.57±14.6598.46±17△△102.67±20.17106.33±15.41△△113.23±15.03##118.9±13.77##

注：SBP：收缩压，DBP：舒张压；与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较:△P<0.05，△△P<0.01；与氯沙坦钾组比较：#P<0.05，##P<0.01

3.2 松龄血脉康对自发性高血压大鼠主动脉病理形态影响

图1显示，从A组图中可看出，模型组大鼠主动脉壁厚薄不一，而对照组和药物组主动脉壁厚度相对均匀；从B组图中可以看出，模型组主动脉壁厚度较对照组明显增加，给药组厚度较模型组有降低。

图1 松龄血脉康对自发性高血压大鼠主动脉病理形态影响注：“←”所示为模型组主动脉壁厚薄不一，“—”表示主动脉内中膜厚度

3.3 松龄血脉康对自发性高血压大鼠血浆AngⅡ的影响

图2显示，高剂量松龄血脉康组AngⅡ水平较模型组明显降低(P<0.01)，且与氯沙坦钾组比较降低显著(P<0.01)；氯沙坦钾组AngⅡ水平较模型组未见明显差异，但有升高趋势，可能与氯沙坦钾与血管紧张素抢占组织中AngⅡ受体，使更多的AngⅡ游离至血液中有关。

图2 松龄血脉康对自发性高血压大鼠血浆AngⅡ的影响注：与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：△△P<0.01；与氯沙坦钾组比较：#P<0.05，##P<0.01(n=10)

3.4 高血压差异表达基因筛选

图3 模型组与对照组qPCR阵列结果

图3、4显示， 以模型组与对照组、高剂量组松龄血脉康与模型组进行对照比较，分析、筛选高血压差异表达基因[5]。本实验中，以高剂量组松龄血脉康与模型组比较，共得到表达有变化基因53个，其中上调22个，下调因子31个，上调基因中差异倍数≥1.5的有12个，下调基因中差异倍数≥1.5的有16个；以模型组与对照组比较，共得到59个有变化的基因，其中上调基因28个，下调基因31个；上调基因中差异倍数≥1.5的有19个，下调基因中差异倍数≥1.5的有20个。

图4 模型组与对照组qPCR阵列结果

表2显示，继而对高剂量松龄血脉康组与模型组比较，模型组与对照组比较结果中的基因按下述条件进行二次筛选：(1)同时存在；(2)基因差异倍数≥1.5；(3)调控趋势相反，最终得到12个差异基因。其中，Clic5、Gch1、Prkg2、Adrb1、Gucy1b3、Mylk2在松龄血脉康与模型组的比较结果中上调，而在模型组与对照组的比较结果中下调；相反，Mas1、Npy1r、Acta2、Mylk、Prkg1、Pde5a在松龄血脉康与模型组结果中下调，而模型组与对照组比较结果中上调。

3.5 松龄血脉康调控高血压相关差异表达基因的网络分析结果

从图5显示，磷酸二酯酶5a(phosphodiesterase 5A，Pde5a)、环磷酸鸟苷酸依赖的1型蛋白激酶(protein kinase，cGMP-dependent, type II，Prkg1)、Prkg2、鸟苷酸环化酶可溶性蛋白亚基1β3(guanylate cyclase 1 soluble subunit beta 3，Gucy1b3)关系密切，各基因间相互作用。String的KEGG pathway分析结果提示，cGMP-PKG通路(map号04022)在被筛选的相关信号通路中处于核心位置，且上述4个基因均参与该通路的活化。

表2 高剂量松龄血脉康组与模型组、模型组与对照组比较所得差异基因

图5 松龄血脉康调控差异基因的网络分析注：红色字母表示高剂量松龄血脉康组上调的基因，黑色字表示下调的基因

4 讨论

松龄血脉康是在“血脉同治”理论的指导下组成的复方，由葛根、鲜松叶、珍珠层粉组成，具有平肝潜阳、镇心安神的功效。其中鲜松叶是松龄血脉康的君药，其性温，味苦，归心、肝、脾经，国内外对松叶的化学成分研究主要集中在挥发油、木脂素、黄酮类、原花青素、莽草酸等化合物，药理研究表明松叶有抗氧化、抗菌、调节血脂、抗衰老等作用[5-7]。葛根为方中臣药，甘平，性凉，主入阳明经，能升举清阳，化浊调脂，《本草纲目》载其:“散郁火”。葛根素是从中药葛根中提取的具有异黄酮结构的单体化合物，广泛用于心脑血管疾病的治疗，能调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统相关活性物质生成，抗氧化应激、抑制组织纤维化，增加胰岛素敏感性，调节血脂和保护内皮[8-9]。松龄血脉康胶囊另一主要成分珍珠层粉是珍珠母去掉中、外层，保留珍珠层研制而成的细粉，其性寒味甘咸，入心、肝经，与鲜松叶配伍增强其平肝潜阳、镇心安神的作用。依“血脉同治”的治疗理念，高血压病患者同时存在脉的病变和血的病变，而脉的病变主要体现在血管内皮损伤、血管平滑肌功能异常等[10]。故本研究以自发性高血压大鼠主动脉为对象，探讨松龄血脉康对血压调控的可能分子机制。

环磷酸鸟苷(cGMP)是一种普遍存在的细胞内第二信使，介导大量的生理过程，在心血管系统中cGMP信号对疾病发生发展有重要调节作用，尤其对血管平滑肌和心肌功能至关重要。cGMP 水平的升高，是NO多种生物效应的分子基础，如松弛血管平滑肌和抑制血小板聚集[11-12]。而cGMP是Gucy1b3(又名sGC)催化一氧化氮(nitric oxide，NO)的产物，同时cGMP活性受磷酸二酯酶(PDEs)的影响，PDEs具有水解胞内第二信使的功能。PDE5选择性地作用于cGMP，cGMP被PDE5水解转化为5-GMP而失活。研究结果表明，松龄血脉康组Gucy1b3显著上调，而 PDE5a水平降低，提示松龄血脉康可能通过增加Gucy1b3活性、抑制PDE5a活性而增加cGMP的生物利用度，最终发挥保护主动脉舒张功能的作用。

cGMP通路下游的另一因子PRKG(又名PKG)在血压调节中也发挥重要作用。多项研究显示，PKG1基因是高血压的易感基因，可通过增加细胞内Ca2+浓度调节血管张力，影响血压[13-14]。研究[10]发现，血管平滑肌细胞长时间接触硝基血管扩张剂、cGMP或cAMP类似物，将可能抑制PKG mRNA及其蛋白的表达[15]。同样，在探讨cGMP干预心肌细胞功能和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxidative stress，eNOS)干预转基因小鼠主动脉功能的研究中，PKG的水平均降低[16-17]，推测cGMP的增加可能导致PKG水平降低，从而降低血压。本研究中PKG1 RNA水平明显降低，提示松龄血脉康可能通过降低PKG1 RNA水平调节主动脉的收缩功能。研究同时发现，与PKG1水平降低相反，PKG2 mRNA的水平显著上调，但由于目前PKG2在高血压中的研究较少，PKG2水平的变化是否对血压产生影响以及产生何种影响，尚需进一步的研究。此外本研究证实，松龄血脉康能显著降低大鼠血浆中AngⅡ水平，与已报道的实验结果一致[3]，提示松龄血脉康的降压作用可能与调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统有关。

综上，松龄血脉康胶囊能平稳降低自发性高血压大鼠的血压，利用qPCR阵列技术和网络药理分析，对松龄血脉康胶囊调控的高血压相关基因进行筛选，发现松龄血脉康可能通过调节cGMP-PKG通路Gucy1b3、PKG1、PDE5a等基因表达而调控大鼠血压，明确了松龄血脉康降压的分子机制，为临床松龄血脉康胶囊的应用提供依据。同时，我们也注意到，Gucy1b3、PDE5、PKG与NO代谢密切相关，而NO是调控氧化应激的重要分子，因此松龄血脉康是否对高血压状态下大鼠氧化应激损伤有保护作用，将是我们后续研究的内容。

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Effects of Songling Xuemai Kang Capsule on the Expression of Hypertension Related Genes in Spontaneously Hypertensive Rats

SHI Wei-li1，WANG Yan2△，XIN Qi-qi1，XU Lei3，TENG Chuan-zhen3，CHEN Ke-ji1△, CONG Wei-hong1

(1.XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing, 100091,China; 2.BeijinguniversityofChinesemedicine,Beijing100029,China; 3.ChengduKanghongPharmaceuticalCo.Ltd.,Chengdu610036,China)

Objective：To investigate the mechanism of Songling Xuemaikang Capsule (SXC) on blood pressure of spontaneously hypertensive rats (SHR). Methods: SHR were randomly divided into model group, high dose SXC group (H-SXC), normal dose SXC group(N-SXC) and losartan group. Blood pressures were measured every week. Pathological morphology of aorta was observed by HE staining. String and KEGG Pathway databases were used for network analysis of differentially expressed genes which related with hypertension and detected with qPCR arrays. Results: Compared with model group, bood pressure of H-SXC and losartan group decreased significantly after 9 weeks of irrigation. AngiotensinⅡlevel declined obviously compared with model group and even losartan group. 12 differentially expressed genes were screened by qPCR arrays and among which 4 genes including Pde5a, Prkg1, Gucy1b3 and Prkg2 participated in cGMP-PKG pathway. Conclusion: SXC could decrease increased blood pressure of SHR, the regulatory mechanism of which might be due to angiotensinⅡ, and the involvement of cGMP-PKG pathway.

Songling Xuemaikang Capsule; Hypertension; qPCR array

北京市“十病十药”研发专项(Z141100002214011)-气血并治颗粒的制剂开发研究

施伟丽(1987-)，女，河南人，在读博士，从事中西医结合心血管疾病的临床与研究。

△通讯作者：陈可冀(1930-)，男，院士，从事中西医结合心血管疾病及老年病的临床与研究，Tel：010-62835037，E-mail：kjchenvip@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)05-0634-04

2016-08-24