基于Na+-K+-ATP酶活性变化评价湿阻中焦证Cajal间质细胞模型的研究

王琦越，杨 旭，王吉娥，陈继兰，黄秀深

(成都中医药大学，成都 611137)

【实验研究】

基于Na+-K+-ATP酶活性变化评价湿阻中焦证Cajal间质细胞模型的研究

王琦越，杨 旭，王吉娥，陈继兰，黄秀深△

(成都中医药大学，成都 611137)

目的：建立湿阻中焦证Cajal间质细胞模型并对其进行评价。方法：湿阻中焦证动物模型建立及动物血清制备；采用Ⅱ胶原酶消化法体外培养ICC，通过湿阻中焦证动物模型含药血清建立体外湿阻中焦证Cajal间质细胞模型，模拟湿阻中焦证大鼠模型体内ICC的生长，以及平胃散含药血清在湿阻中焦证治疗中对ICC细胞的调节机制，反证证候细胞模型建立成功。结果：细胞造模后细胞内Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-Atpase)活力下降，K+浓度及ATP升高，ICC细胞无氧代谢能力增强；湿阻中焦证细胞经平胃散血清干预后，与自然恢复组比较平胃散组ICC细胞Na+-K+-Atpase和K+活性升高明显、ATP下降、LDH活力降低。结论：湿阻中焦证ICC模型细胞与正常ICC存在差异，证侯细胞模型建立成功；钠钾泵活性的改变可能是湿阻中焦证的基本病理改变之一，平胃散可能通过恢复钠钾泵活性阻断K+浓度的下降趋势，影响中焦湿阻证Cajal间质细胞代谢。

中医证候细胞模型；湿阻中焦证模型；平胃散；

湿阻中焦证是脾胃病的一类常见证型，起病具有广泛性、隐匿性和复杂性等特点，严重影响生活质量，甚至给临床各科的治疗带来诸多障碍。李连成[1]对石家庄1005人的抽样调查显示，符合湿阻者106人，患病率为10.55%。李克穷[2]对甘肃1735人的抽样调查显示，符合湿阻者211人，患病率为12.16%，说明湿阻中焦证研究的迫切性需引起重视。近年来,对湿阻中焦证的研究多从动物模型或胃肠道消化、吸收、运动机能减退等方面进行,亦有一部分学者认为湿阻中焦证的产生是源于细胞自身功能障碍。黄秀深[3]、隆淑芬[4]等先后对湿阻中焦证大鼠红细胞膜、脑细胞膜研究发现Na+-K+-Atpase功能低下。本实验以前期较成熟的湿阻中焦证动物模型为平台建立体外中医证候细胞模型，研究湿阻中焦证ICC内Na+-K+-Atpase活性的变化，以探索适宜Cajal间质细胞中医证候模型的评价方法。

1 材料

1.1 动物

SD大鼠40只，雌雄各半，体质量180～220 g，由成都中医药大学实验动物中心提供(合格证号SCXK(川)2004-11)，检疫后备用。昆明种小鼠雌雄不拘，出生后10～15 d左右，由成都中医药大学实验动物中心提供(合格证号SCXK(川)2004-11)，检疫后备用。

1.2 药物

平胃散配方：苍术24 g，厚朴18 g，陈皮12 g，炙甘草6 g,上药购自同仁堂成都分店，经成都中医药大学制剂室鉴定合格。先将药物加水 500 mL浸泡 1 h，然后与大枣2枚、生姜2片一同煎煮至300 mL 左右，再浓缩成浓度为1 g生药/ml的药液，4℃冰箱保存备用。

1.3 试剂

M199培养基(Gibco)，SCF(Peprotech)，Ⅱ型胶原酶(Gibco)，优级新生牛血清(民海生物工程有限公司，Lot.No.20090521)，青霉素(哈尔滨制药六厂，批号 0903311)，链霉素(哈尔滨制药六厂，批号070201)，无水乙醇0.01 mol/L PBS，大鼠抗小鼠c-kit抗体(武汉博士德)，羊抗大鼠FITC标记荧光抗体(Vector)，封闭用羊血清(北京中杉金桥)，Ficoll400(Pharmacia)， Na+-K+-ATP 酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20090723)，钾测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号 20090923)，The CellTiter-Glo© Luminescent Cell Viability Assay 试 剂(Promega, SystemLot#259984)，LDH 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号 20090923)。

1.4 仪器

相差倒置显微镜(Leica,090-35.008-000型，Germany)，酶联免疫检测仪(BIO-RAD,Mdel550型)，免疫荧光显微镜(Leica,DMIRE2)，二氧化碳培养箱(SANYO,MCO-15A型，JAPAN)，干热消毒箱，高温蒸汽灭菌高压锅。

2 方法

2.1 湿阻证动物模型建立与分组

SD大鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，正常组10只，造模组30只。模拟中医发生湿困脾胃的病因“久居湿地，饮食不节，饥饱失常，睡眠减少，情志不遂”[5]，使大鼠居住在温度18～25℃、湿度90%以上的造模箱内，每日上午用小站台法控制睡眠时间5 h，单日禁食并给予4℃冰水灌胃1次(2 ml/只)，双日供足充足饲料并给予猪油灌胃1次(4ml/只)，连续20 d。实验过程中每天密切观察大鼠的一般状态，即粪便形状、性状、精神状态、被毛色泽、活动状态等，各组分别于造模前后及治疗后各测量体质量1次。造模后动物的大便见黄褐色稀溏便，被毛色泽灰暗，体质量减轻，活动量小，饮食进水量较前减小。这些症状基本接近湿困脾胃证中湿邪困阻中焦的症状表现，认为动物模型成功。将造模后的30只SD大鼠又随机分为模型组10只，平胃散治疗组10只，自然恢复组10只。

2.2 血清制备

2.2.1 湿阻中焦证组模型血清制备 造模20 d后取血清，血清在室温下静置2～4 h，离心取上清。56℃灭活30 min，过滤除菌，-20℃冰箱保存备用。

2.2.2 其他组血清制备 停止造模后，灌胃平胃散(10 ml/kg)共3 d。同时自然恢复组和正常灌胃组0.9N.S(10 ml/kg)第3天灌胃1 h后取血清，血清在室温下静置2～4 h后离心取上清。56℃灭活30 min，过滤除菌-20℃冰箱保存备用。

2.3 体外小鼠小肠 ICC的培养和鉴定

2.3.1 ICC的培养 小肠组织单细胞悬液制备[6]：小鼠禁食12 h后，在无菌条件下取距离回盲部10 cm的小肠放入培养皿，剥去小肠系膜和血管，用PBS液(pH7.0，青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)在50 ml小烧杯中将小肠内容物冲洗干净，将小肠用2 ml注射器针头纵行剖开小肠，剖去小肠黏膜层，PBS液反复冲洗肌条3～4次，将肌条剪碎至1～2 mm3小块后放入小烧杯中，加入Ⅱ型胶原酶(1.3 mg5ml-1)，37℃消化30 min，过 200 目筛网，将含细胞的滤液1500 r离心3 min去上清，再重悬细胞 1次，细胞加在等体积Ficoll400梯度密度液上，3000 r离心10 min，取液面交界细胞沉淀。用 M199培养基将细胞密度调整至1×106个/ml接种至 6 孔培养板，板中预先放置包被鼠尾胶原(2 ng/cm2)的盖玻片。放置培养箱，在37℃ 5% CO2条件下培养。细胞培养24 h后换液，冲去未贴壁细胞，加入培养基继续培养，以后每3～4 d换液1次，期间用倒置显微镜下观察细胞生长情况。细胞稳定培养7 d后，进行免荧光检测以确定是否为ICC细胞。

2.3.2 ICC的鉴定 通过Cajal间质细胞的生长和形态学改变进行鉴定——体外培养小鼠小肠ICC特征性形态特点[7]：接种24 h后，ICC即可贴壁，细胞最初呈三角形或梭形，并有少量短突起。72 h可形成较长突起并与周围细胞形成网络状突起连接。体外培养7d后，ICC可以伸出二级、三级突起，可形成较复杂的网状连接。

2.4 含药血清及相关血清细胞给药浓度确定

预实验中，分别用 10%、15% 和20%的平胃散含药血清作用于ICC细胞，发现当含药血清浓度为15%，对ICC的作用强于10%和20%浓度的含药血清，对ICC 细胞的干预作用最明显。因此，选择15%含药血清浓度作为本实验的给药浓度。

2.5 细胞造模及细胞分组给药

将培养第7天的正常ICC分为正常组(给细胞加入2次正常组动物的血清)、模型组(给细胞加入2次湿证模型血清)、自然恢复组(先给细胞加入湿证模型血清,之后再给细胞加入自然恢复组的血清)、平胃散组(先给细胞加入湿证模型血清,之后再给细胞加入平胃散含药血清)、四君子汤组(先给细胞加入湿证模型血清,之后再给细胞加入四君子含药血清)，2次加血清时间间隔24 h，24 h后检测指标。

2.6 样本制备及指标测定

将待检测的细胞制成细胞悬液移入离心管，以1500 rpm 离心15 min弃上清液。用不含血清的M199培养基洗3次弃上清液，加入200 μl去离子水，手动匀浆机破碎细胞，然后严格按照测定试剂盒说明操作。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 模型细胞与正常 ICC的形态差异

图1显示，倒置显微镜下观察生长7 d的ICC形态，发现正常组ICC细胞ICC伸出二级、三级突起，从而形成较复杂的网状连接，这种连接是其慢波功能的结构基础(详见图A)；湿阻中焦证模型细胞形态发生变化，细胞变平，突触连接紧密，细胞缝隙变小，网络连接不明显(详见图B)。

图1 模型细胞与正常ICC的形态差异(10×40)注：A.正常ICC;B.湿阻中焦证ICC

3.2 模型细胞与正常 ICC的差异

表1显示，与正常 ICC 比较，模型组细胞内 ATP 明显提高(P<0.01)、K+浓度升高(P<0.01)，LDH 明显增强(P<0.01)，但模型组细胞内Na+-K+-Atpase明显降低(P<0.01)。

组 别例数浓度(ng/ul,%)ATP(U/mg)Na+-K+-ATP(U/mg)K+(U/mg)LDH(U/mg)空白组6151892217.33±25523.752.99±0.190.14±0.001.38±0.06正常组6151750106.33±22903.883.80±0.380.10±0.000.44±0.05模型组6152327674.00±48830.90**2.78±0.28**0.12±0.00**0.60±0.05**

注：与正常组比较：**P<0.01

3.3 湿阻中焦证动物模型血清对模型ICC的影响

表2显示，与正常组ICC 比较，模型组、自然恢复组及四君子汤组细胞内ATP均升高(P<0.01)，其中平胃散组ATP明显降低(P<0.01)；与正常组ICC比较，自然恢复组LDH降低(P<0.01)，模型组、四君子汤组细胞内LDH却有升高趋势，但差异无统计学意义；与正常组比较，模型组、自然恢复组、平胃散组及四君子汤组Na+-K+-Atpase活力均降低(P<0.01)，其中平胃散组Na+-K+-Atpase活力最强，而四君子汤组Na+-K+-Atpase活力最弱(P<0.01)；与正常组比较，模型组、自然恢复组、平胃散组及四君子汤组K+均升高(P<0.01)。

组 别例数浓度(ng/μl,%)ATP(U/mg)LDH(U/mg)Na+-K+-ATP(U/mg)K+(U/mg)正常组6151750106.33±22903.88 0.44±0.053.80±0.380.10±0.00模型组6152327674.00±48830.90**口口0.60±0.052.78±0.28**0.12±0.00**自然恢复组6151838815.33±48604.12**0.17±0.06**△△2.32±0.29**0.11±0.00**平胃散组6151203424.00±18626.08**0.42±0.04口口3.50±0.11△△口口0.12±0.00**四君子汤组6152461678.66±68393.11**△△口口0.46±0.04口口1.53±0.16**△△0.11±0.01**

注：与正常组比较:**P<0.01；与模型组比较:△△P<0.01；与自然恢复组比较:口口P<0.01

4 讨论

湿阻中焦证又称湿困脾胃证，是指湿邪阻滞脾胃，中焦气机失于宣畅，运化功能减弱的病症。临床表现为全身困重倦怠、腹胀纳呆、口黏苔腻及血清胃泌素降低、胃肠推进迟缓[8]等。胃肠节律的发生起源于胃肠道内的 Cajal 间质细胞(interstitial cell of Cajal，ICC)，ICC 是目前胃肠道节律运动的发起者和调控者[9]。现代研究认为，湿阻中焦证的病理改变以胃肠运动紊乱与水液代谢障碍为主。而钠钾泵是一种镶嵌在细胞膜上具有ATP酶活性的特殊蛋白质，维持着细胞内外离子的正常分布和渗透压平衡，进而维持细胞内外的水平衡。

本研究通过造模成功的动物模型[10]血清建立湿阻中焦证ICC细胞模型。从研究结果来看，ICC细胞形态发生了一系列明显变化，与前期研究发现胃肠动力障碍患者ICC 细胞数量减少、形态和网络结构变化一致，提示湿阻中焦证ICC 细胞模型从形态上看出了胃肠动力障碍表现。此外，位于细胞膜上的Na+-K+-Atpase通过消耗能量保持着细胞内外k+浓度差和渗透压平衡，内源性三磷酸腺苷(ATP)是活细胞代谢最重要的能量来源，而乳酸脱氢酶(LDH)作为一种主要的无氧酵解酶参与细胞的无氧代谢。造模后细胞内Na+-K+-Atpase酶活力明显下降，K+浓度及ATP升高，无氧代谢能力增强，说明正常ICC经造模后细胞代谢发生了一定变化，提示模型细胞与正常ICC存在差异，推测湿阻中焦证证候细胞模型建立成功；且模型细胞Na+-K+-Atpase活力明显下降，K+浓度升高，提示钠钾泵活性的下降是中焦湿阻证的基本病理改变之一。中医认为，脾胃功能与水谷精微物质的吸收相关。《素问·经脉别论》云:“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精,上归于肺，通调水道，下输膀胱。水精四布，五经并行。”湿困脾胃证中脾胃功能被阻遏，致使水谷精微不能正常运化吸收，必然导致物质能量代谢的失常，从而致Na+-K+-Atpase活力降低。

平胃散是针对湿阻中焦证而创立的经典方剂，可通过提高免疫改善肠黏膜屏障功能治疗湿困脾胃证[11-12]，所以选用平胃散进行药物反证。本实验中焦湿阻证 ICC 细胞经平胃散治疗后，钠钾泵的活性恢复明显优于自然恢复组，并阻断K+浓度的下降趋势，进一步说明中焦湿阻证的病理改变与细胞膜钠钾泵活性降低有关。平胃散可能通过恢复钠钾泵活性，阻断K+浓度的下降趋势，影响中焦湿阻证Cajal间质细胞代谢，从而调节胃肠道的运动功能。平胃散组ICC细胞内钠钾泵活性增加，耗能增加，ATP减少。平胃散降低中焦湿阻证 ICC 细胞内乳酸脱氢酶(LDH)活力，抑制湿证 ICC 细胞内的无氧代谢，提高细胞有氧代谢。四君子汤为治疗脾气虚证的代表方，作用不及平胃散。本研究中用于佐证湿阻中焦证ICC细胞模型建立成功。本实验发现，湿阻中焦证ICC模型细胞与正常ICC存在差异，证侯细胞模型建立成功；钠钾泵活性的改变可能是湿阻中焦证的基本病理改变之一。平胃散可能通过恢复钠钾泵活性，阻断K+浓度的下降趋势，影响中焦湿阻证Cajal间质细胞代谢。本研究从细胞分子水平揭示湿阻中焦证能量代谢情况，也是体内中药复方作用机制在体外研究的延伸, 对体外中医证候细胞模型的建立作创新性的尝试，为中医“证”的研究提供新的研究思路和方法。目前细胞模型尚存在不足，国内外许多学者正致力于完善细胞模型，已经有研究[13]致力于改进培养条件，发展自动化、微型化的细胞模型，旨在扩大其应用范围和评价效率，细胞模型将具有很好的开发前景。

[1] 李连成,路志正. 湿阻的流行病学调查[J]. 中医杂志,1992,26(6):44-45.

[2] 王克穷,张立华,刘伟. 湿阻脾胃证的流行病学调查及相关因素的初步研究[J]. 中国中医基础医学杂志,1996,2(2):41-44.

[3] 黄秀深,赵燕,张力华,等. 中焦湿阻证大鼠红细胞膜Na～+-K～+ATP酶活性研究[J]. 成都中医药大学学报,2000,23(4):23-24.

[4] 隆淑芬,黄秀深,罗玉熙,等. 湿困脾胃证大鼠脑组织Na～+-K～+-ATP酶活性的实验研究[J]. 成都中医药大学学报,2007,30(3):36-37.

[5] 周艳霞,黄秀深,孙改侠,等. 平胃散对湿困脾胃证大鼠肠黏膜机械屏障的调控作用[J]. 甘肃中医,2009,8:64-65.

[6] 李春穴,童卫东,刘宝华,等. Cajal间质细胞的分离、培养方法探讨[J]. 消化外科,2004,04:267-269.

[7] JONES MP.BRATTEN J R.BrattenJR.Small intestinal motility[J].Curr Opin Gastro-enterol,2008,24(2):164.

[8] 邱赛红,陈立峰,柳克铃,等. 芳香化湿药开胃作用机理的实验研究Ⅱ对湿困动物模型的影响[J]. 中药药理与临床,1997,13(2):2-5.

[9] WALLANCE AS，BURNS AJ.Development of the enterie nervous systerm,smooth muscle and interstitial cells of Cajal in the human gastrointestinal tract[J].Cell Tissue Res,2005,319(3)：367.

[10] 张丰华,黄秀深. 平胃散对湿阻中焦模型醛固酮和神经降压素的影响[J]. 时珍国医国药,2008,19(11):2781-2782.

[11] 黄秀深，沈涛，刘伟，等.大鼠湿困脾胃证动物模型部分免疫功能的实验研究[J].中医杂志，2007,48(8):730-732.

[12] 刘德芳,黄秀深,张丰华,等.大鼠湿阻中焦证的水盐代谢调节机制及平胃散对其的影响[J].中国中医药信息杂志，2005,12(1):26-27.

[13] GALKIN A, PAKKANEN J, VUORELA P. Development of anautomated 7-day 96-well Caco-2 cell culture model[J].Pharmazie, 2008, 63(6): 464-469.

Study on Evaluation of Interstitial Cells of Cajal Model in Dampness Obstructing Spleen and Stomach Syndrome Based on the Na-K-ATP Enzyme Activity Changes

WANG Qi-yue,YANG Xu,WANG Ji-e,CHEN Ji-lan,HUANG Xiu-shen△

(ChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China)

Objective: Establishement and evaluature of of interstitial cells of Cajal spleen and stromach bloked by dampness syndrone in vitro study.Methods: The dampness obstructing spleen stomach syndrome animal model establishment and animal serum preparation; ICC cultured in vitro by collagenase Ⅱ,The dampness containing animal serum in vitro model of middle energizer dampness obstructing spleen stomach syndrome of interstitial cells of Cajal model,Simulation of rat model in vivo ICC growth,Pingwei power and serum regulating mechanism of ICC cells in the treatment of dampness syndrome.The successful establishment of cell model counterevidence syndrome.Results:After the cell model was made, the Na+-K+-ATP enzyme activity decreased, K+concentration and ATP increased, and the anaerobic metabolism ability of ICC cells was enhanced.Wet resistance of middle energizer cells through a flat stomach scattered serum intervention, and natural recovery group compared, flat stomach scattered group ICC Na+-K+-ATPase and K activity was significantly increased, the decline in ATP and LDH activity decreased.Conclusion:The dampness obstructing spleen stomach syndrome ICC model cells and normal ICC have differences. The successful cell model was established successfully,the sodium pump activity is the basic pathological change in the change of the dampness obstructing spleen stomach syndrome,and the level of the stomach may be through the recovery of sodium potassium pump activity,Blocking the downward trend of K+concentration of dampness obstructing spleen stomach syndrome in the Cajal interstitial cell metabolism.

TCM Syndrome Model;The dampness obstructing spleen stomach syndrome rat model;Ping Wei powder

国家自然科学基金资助项目(81373544)-平胃散对湿阻中焦证AQPS损伤致水平衡失调

王琦越(1992-)，女，医学学士，从事消化系统疾病复方配伍规律的理论、临床与实验研究。

△通讯作者：黄秀深(1955-)，男，重庆人，教授，从事消化系统疾病复方配伍规律的理论、临床及实验研究，Tel：13608031734，E-mail：jcbl7747@sina.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)05-0630-04

2016-09-11